1、选修1课时13 多聚酶链式反应扩增DNA片段班级:_姓名:_设计人_日期_课前预习 预习案 学习目标 1 1体验PCR常规的分子生物学实验方法。2理解PCR的原理。3讨论PCR的应用。 自主梳理 1 1PCR原理：(1)概念：PCR，即_，能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，是一种体外迅速_的技术。(2)原理。DNA变性：在_的温度范围内，_解体，双链分开的过程。DNA复性：当_后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链的过程。DNA合成：DNA聚合酶从引物的_开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的_向_延伸。(3)条件2PCR的反应过程：(1)循环次数：
2、一般是_次。(2)过程。变性：当温度上升到_时，双链DNA_。复性：温度下降到_，两种引物通过_与两条单链DNA结合。延伸：温度上升到_，溶液中的四种脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(3)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于_之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_扩增。3PCR的实验步骤：准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液：用_按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液_离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在_反应：将离心管放入_中，设置程序进行反应4PCR
3、的操作提示：(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的一些用具及缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行_。(2)PCR所用的缓冲液和酶应_，并在_下储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都_。所有成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁， 使反应液_。5DNA含量的测定：稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零：以_作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零测定：取DNA稀释液100 L至比色杯中，测定260 nm 处的光吸收值计算：DNA含量(g/mL) =_ 预习小测 1 1
4、判断正误：DNA聚合酶能延伸子链的3端或5端。2判断正误：PCR反应始终在高于70 C的条件下进行。3判断正误：Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加。4判断正误：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。5判断正误：高压灭菌的微量移液器枪头每吸取一种试剂后不需要更换。6判断正误：做PCR使用的微量离心管是一种薄壁玻璃管。知识拓展 探究案 探究1PCR技术的基本原理及条件 1 1PCR技术的概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种_迅速_的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2PCR技术的原理：(1)DNA的热变性在_C的温度范围内，DNA双螺旋结构解体
5、，_分开，这个过程称为_。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。(2)子链的合成需要_；合成方向总是从子链的_。3PCR技术的条件(1)_模板。(2)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种_。(3)四种脱氧核苷酸。(4)耐热DNA聚合酶，一般用_DNA聚合酶。(5)需要一定的_和能严格控制_的温控设备。4PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(一0H)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA 链，即DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。5PCR原理DNA的热变性原理通过控制温度来控制
6、双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上是一台能够自动控制温度的仪器。6Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是从一种水生嗜热菌Taq中分离提取的。Taq是一种嗜热细菌，能在7075C环境中生长， 该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中发现的。TaqDNA聚合酶的发现解决了高温使普通的DNA聚合酶失活的矛盾。 典例精析 1 (PCR的原理)下列关于DNA 复制和PCR技术的叙述，正确的是A.两者都能使DNA扩增，反应条件基本相同，即模板、原料及所需酶相同B.前者所需引物是DNA单链，后者所需引物是RNA 单链C.两个过程中所需的DNA聚合酶是完全相同的物质D.PCR技术中，DNA
7、的合成方向总是从子链的5端向3端延伸 变式训练 1 如果在案件侦破过程中，搜集到一根毛发，但它所含的遗传信息量太少，该怎么办呢？ 探究2PCR的反应过程及实验操作与评价 1 7PCR的反应过程(1)过程PCR般要经历30多次循环，每次循环可以分为_、_和_三步，所需要的温度分别约为:_C、_C、_C。从第二轮循环开始，上一次循环的产物作为模板，参与反应，并且由_延伸而成的DNA单链会与_结合，进行DNA的延伸。(2)结果DNA聚合酶能特异的复制处于_的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_扩增。8PCR的实验操作：(1) 实验用具PCR仪:该仪器能自动调控_，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，
8、可用3个恒温水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。微量离心管：总容积为_，实际上是进行_的场所。微量移液器：用于_PCR配方中的液体。(2)操作步骤准备加入组分混合_反应(3)操作提示为避免_等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行_。所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在一20 aC储存。在_中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。9DNA含量的测定(1)测定方法紫外分光光度计法。(2)步骤反应液稀释：取2 L_反应液，添加98 L_。分光光度计调零:将100_添加到_中，在_处将分光光度计读数调整为_。将100 L反应稀释液倒入比色
9、杯中，测定在260 nm处的光吸收值。计算：DNA含量(g/mL) =_。10PCR反应的条件(1)稳定的缓冲液环境PCR反应需要在一定的缓冲溶液中，提供DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶。(2)能严格控制温度变化的温控设备11PCR的反应过程(1)变性在80100 C条件下，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。(2)复性在2565 条件下，系统温度降低，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合，形成局部双链。(3)延伸在7075条件下，在Taq DNA聚合酶(在72 左右活性最高)的作用下，以溶液中的四种脱氧核苷酸为原料，从引物的5端到3端方向延伸，
10、根据碱基互补配对原则合成与模板链互补的DNA链。特别提醒:PCR的结果(1)PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作模板参与反应，并且由引物I延伸而成的DNA单链会与引物II结合，进行DNA 的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增。(2)PCR般要经历30多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为230。12PCR反应的实验操作(l)PCR仪PCR仪自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸第1次94 ,5 min30次94 ，30 s55，30 s72 C,1 min最
11、后一次94 C , 1 min55 ,30 s72 ，1 min若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替。三个恒温水浴锅的温度分别为94、55 和72，然后按照上表要求， 在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)操作步骤准备:按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液:用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁离心:将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在离心管底部反应:将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(3)实验中DNA含量的测定理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2，但实际
12、可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。13PCR技术的实验操作评价如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有:漏加了 PCR的反应成分，各反应成分的用量不当， PCR程序设置不当等。特别提醒：PCR反应体系的配方是经多次实验后确定的， 各种成分的用量基本能满足实验反应需要。实验时，不要过多增加用量，以免造成浪费。PCR的反应成分包括稳定的缓冲液环境、DNA模板、两种引物、脱氧核苷酸混合液、Taq DNA聚合酶。 典例精析 1 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是A.95C、55C、72 CB.72 C 、55 C 、95 CC.5
13、5 C 、95 C 、72CD.80 C 、55 C 、72 C 变式训练 1 使用PCR仪的具体实验操作顺序应为设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A.B.C.D. 随堂自测 1 1下列说法不正确的是A.一条DNA母链只有一个3端，即羟基末端B.DNA的两个3端位于相反的两端C.Tag DNA聚合酶只能与引物的3端结合并延伸子链D.DNA的合成方向是从子链3端向5端延伸的2标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是A.92、50、72B.72、50、92C.50、92、72D
14、.80、50、723在DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是4假设PCR反应中有2个DNA的片段作为模板，在5次循环后反应物中大约有多少个这样的DNA片段A.64B.32C.16D.85聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述30多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性(引物与DNA模板链结合)72下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是A.95高温破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C.延伸过程中需要热稳定DNA
15、聚合酶和四种dNTP (合成DNA的原料)D.引物为一小段RNA6如图为DNA变性和复性示意图，下列相关说法正确的是A.向右的过程为加热(80100)变性B.向左的过程是DNA双链迅速致冷复性C.变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D.图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3端7PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答问题。(1)A过程高温使DNA变性解聚，对该过程的原理叙述，正确的是_。A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键C.该过程不需要解旋酶的作用D.该过程与人体细胞的过程完全
16、相同(2)C过程要用到的酶是_。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以_加入，_(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：_。(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“945572”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占_。 探究归纳 1 特别提醒:PCR技术与体内DNA复制的比较(见下表)比较项目细胞内DNA复制PCR技术不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80100 C高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶引物RNADNA或RNA温度体内温和条件高温次数
17、受生物体自身控制循环30多次相同点 需提供DNA复制的模板 四种脱氧核苷酸作原料 子链延伸的方向都是从5端到3端选修1课时13 多聚酶链式反应扩增DNA片段详细答案课前预习 预习案【自主梳理】1(1)多聚酶链式反应 扩增DNA片段(2)80100C DNA的双螺旋结构 温度缓慢降低 3端5端 3端(3)DNA的两条单链 两种引物脱氧核苷酸 耐热 TaqDNA聚合酶2(1)三十多(2)90 C以上 解聚为单链 50C左右 碱基互补配对 72C左右 DNA聚合酶(3)两个引物 指数3微量移液器 混合均匀 离心管底部 PCR仪4(1)高压灭菌 (2)分装成小份 -20C (3)必须更换 混合均匀5蒸
18、馏水 50(260 nm的读数)稀释倍数【预习小测】123456知识拓展 探究案【探究1PCR技术的基本原理及条件】1体外扩增 DNA片段2(1)80100 双链 变性 (2)引物 5端向3端延伸3(l)DNA (2)引物 (4)耐高温的Tq (5)缓冲溶液 温度【典例精析】D【变式训练】用PCR技术扩增DNA片段，短时间内就能扩增出足量的DNA，供分析研究和检测鉴定。【探究2PCR的反应过程及实验操作与评价】7(1)变性 复性 延伸 95 55 72 引物I 引物II (2)两个引物之间 指数8(1)温度 0.5mL 多聚酶链式反应 转移 (2)设置PCR的循环程序 (3)外源DNA 高压灭
19、菌 微量离心管9(2)PCR 蒸馏水 蒸馏水 比色杯 260 nm 零 50 (260 nm的读数) 稀释倍数【典例精析】A【解析】无【备注】无【变式训练】C【解析】PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器,设计好循环程序就可以进行反应了。故C正确。【备注】无【随堂自测】1D2A3C4A5D6A7(1)C(2)DNA聚合酶 一次 不需要 DNA 模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等(3)25%【解析】PCR技术用高溫使DNA两条链解开，该过程不需要解旋酶的作用。C过程是链的延长，需要DNA聚合酶参与；PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等。循环3次共形成8个DNA分子，其中两个DNA分子含15N标记，占总数的25%。