1、微生物的分离鉴定与计数一、微生物的分离与鉴定1分离微生物的原理与措施(1)原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的微生物与其他微生物分离，再给该微生物提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。(2)常用措施：接种过程中尽量使微生物分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。2选择培养基四种常见制备方法或实例【典例1】(2019全国卷)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W
2、的细菌(目标菌)。回答下列问题。(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是_。(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择_菌落进一步纯化，选择的依据是_。(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_。(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴
3、加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_，三处滴加量相同。一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明_；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_。解析：(1)该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物，故可作筛选培养基中的氮源。(2)研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙菌落的周围出现透明圈，说明乙菌落能够降解物质W，故乙菌落为该小组的目标细菌。(3)目标菌能够利用空气中的氮气作为氮源，故选用的筛选培养基不添加氮源，能够在无氮源的培养基上生存的细菌便是目的细菌，故实验操作为：将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细
4、菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)C处作为空白对照，要排除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且保持滴加量相同；培养基中的透明圈表示物质W被降解的情况，若C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降解物质W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即酶E与天然酶降解物质W的能力相近。答案：(1)W(2)乙乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源(4)缓冲液缓冲液不能降解W酶E与天然酶降解W的能力相近选择培养基的设计方法(1)营养缺陷型选择培
5、养基：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。(2)添加抑菌物质的选择培养基：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对非目的微生物产生的抑制作用选择目的菌。(3)特殊培养条件的选择培养基：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等)。(2020周口质检)烧伤病人容易感染绿脓杆菌，引起化脓性感染。比阿培南、美罗培南、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素都是非常经典的抗绿脓杆菌的药物。临床使用时，有时需要做细菌耐药实验。实验时，从病人身上获取少量样本，按下列一定的实验步骤操作，以确定病人体内的绿脓杆菌对不同抗生素的敏感性。(1)获取绿脓杆菌单菌落。配制培养基。主要步骤是计算称量溶
6、化_分装倒平板。图2所示接种方法为_法，这种方法的主要目的是使接种物_。图1的操作中，第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，第二次及之后的几次划线前灼烧接种环的目的是_。在图2所示操作前，需要随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是_。(2)检测绿脓杆菌对不同抗生素的敏感度。绿脓杆菌对不同抗生素的敏感度的对比、对照实验结果如图3所示：在恒温箱培养3天后，培养基上有绿脓杆菌滋生，且除浸有无菌水的圆纸片外，其他浸有美罗培南、比阿培南、头孢菌素或碳青霉烯类抗生素的圆纸片周围都出现了抑菌环。如果你是医生，建议患者最好选用_抗生素，判断的理由是_。(3)菌种保藏将分离纯化后的菌株
7、接种到_上，在适宜条件下培养。当菌落长成后，将试管置于4 冰箱中保藏待用。(4)常采用_法统计活菌数目，直接从静置的培养液中取样计数的做法是错误的，正确的操作是_。答案：(1)调pH和灭菌平板划线逐步稀释(以便获得单个菌落)杀死上次划线后接种环上残留的菌种(使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端)检测培养基平板灭菌是否合格(2)美罗培南抑菌圈最大，说明对绿脓杆菌的杀伤效果最好(3)固体斜面培养基(4)稀释涂布平板法将培养液摇匀后取样计数二、微生物的计数1间接计数法(活菌计数法)稀释涂布平板法(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活
8、菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。(2)操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。计算公式：每克样品中的细菌数(C/V)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂
9、布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。2显微镜直接计数法(1)原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定面积(1 mm2)和高(0.1 mm)的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。(2)操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，稍等片刻，待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样
10、品中所含的细菌数。(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。3滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例，将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。【典例2】(2020清远期末)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离和培养等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，_；然后，将1 mL水样稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0
11、.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为_。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过_灭菌，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落，在第二次及以后的划线时，一定要_。示意图A和B中，_表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。通常，对获得的纯菌种可以依据_对细菌进行初步的鉴定和分类。(3)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高
12、_的利用率。解析：(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，可以随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。由题意知1 mL水样中的菌落数是(393837)30.11 0003.8105，每升水样中的活菌数为3.81051033.8108。(2)接种环用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是：通过划线次数的增加，将聚集的菌体逐渐稀释分散，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便获得由单个细胞繁殖而来的单个菌落。图A是用平板划线法接种培养后得到的结果，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。可以依据菌落的形状、大小等特征对细菌
13、进行初步的鉴定和分类。(3)振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。答案：(1)随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间3.8108(2)灼烧从上一次划线的末端开始划线B菌落的形状、大小等菌落特征(3)溶解氧营养物质用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30300 的平板进行计数。解题时易出现以下误解：(1)只得到1个菌落数在30300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶发因素的影响。(2)得到3个或3个以上菌落数在30300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：不同平板间差异较大，如
14、得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30300”之间，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。(2020安顺模拟)牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图1所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：(1)巴氏消毒的方法是_，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是_。(2)取最终的牛奶稀释液0.1
15、 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图2中的_。(3)图1中所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为_个，运用这种方法统计的结果往往较实际值_(填“偏大”或“偏小”)，原因是_。(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？_。(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入_，若菌落具有_特征，则可以认定为大肠杆菌。解析：(1)巴氏消毒的方法
16、是在7075 煮30 min或在80 煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。(2)涂布使用的工具是涂布器，图2中B正确。(3)菌落的平均数是34个，生牛奶中每毫升含细菌数稀释倍数1043.4106个/mL。在统计菌落时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，所以可减少稀释次数。(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。答案：(1)在7075 煮30 min(或在80 煮15 min)牛奶的营养成分不被破坏(2)B(3)3.4106偏小个别菌落可能是由两个或多个细胞形成的(4)减少稀释次数(5)伊红美蓝(金属光泽的紫)黑色
