1、专题2 微生物的培养与应用一、微生物的实验室培养1.培养基及其配制(1)培养基的概念:人们按照微生物对_的不同需求,配制出供其生长繁殖的_。(2)培养基的成分:一般都含有水、_(提供碳元素的物质)、_(提供氮元素的物质)和无机盐。还需要满足微生物生长对_、特殊营养物质以及_的要求。营养物质营养基质碳源氮源pH氧气2.无菌技术措施:():,特点 指使用较为温和的物理或化学方法仅杀灭物体表面或内部一部分对人体有害的微生物 不包括芽孢和孢子煮沸消毒法消毒常用方法 化学药剂消毒法紫外线消毒法特点 指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物 包括芽孢和孢子灼烧灭菌灭菌常用方法 干热灭菌高压蒸汽灭菌3.
2、实验操作:pH:():配制培养基 称量混合溶化调分装包扎灭菌 加水加培养基密封排冷气维持压力 取出倒平板 或搁置斜面接种过程 洗净双手点燃酒精灯接种贴标签接种工具 包括接种环、涂布器接接种方法 平板划线法、稀释涂布平板法种注意事项 整个操作过程都要在酒精灯火焰旁完成培养 接种后的培养皿放入恒温箱内培养4.菌种保藏:,4,3 6,:,:,20操作 采用固体斜面培养基 菌落长成后 放入 冰箱中保藏 以后每个月 转移到临时 新的培养基保藏 缺点 保存时间不长 菌种易被污染或产 生变异长期保存法 甘油管藏法 放在下保存 即时训练1科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力,因
3、而受到了研究者的重视。(1)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。(2)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后,比较两种培养基中菌落的 ,确定该蛋白质的抗菌效果。(3)细菌培养常用的接种方法有 和 。实验结束后,对使用过的培养基应进行 处理。答案:(1)碳源 氮源(2)数量(3)平板划线法 稀释涂布平板法灭菌解析:实验室常用的培养细菌的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法操作简单方便,但是单菌落不容易分离;稀释涂布平板法操作复杂,但单菌落容易分离。特别要注意微生物的实验室培养本着“无菌操作
4、”的理念,包括实验结束后对使用过的培养基应进行灭菌处理,以避免造成污染。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 即时训练2自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯,然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验,请回答有关问题。步骤如下:制备稀释倍数为102,103,104,105,106的系列稀释液。为了得到更加准确的结果,应选用 法接种样品。适宜温度下培养。结果分析:(1)测定的大肠杆菌数,在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下几种统计结果,与事实更加接近的是 。A.一个平板,统计的菌落数是23B.两个平板,统计的菌落数是22和26,取平均值24C
5、.三个平板,统计的菌落数分别是21,5和52,取平均值26D.四个平板,统计的菌落数分别是21,30,24和25,取平均值25(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为23.4,那么每升样品中的菌落数是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)。(3)用这种方法测定密度,实际活菌数量要比测得的数量 (多、少),因为。(3)多 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察的是一个菌落解析:若对大肠杆菌进行计数,则需要用稀释涂布平板法接种样品。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板计数,取其平均值。(2)23.40.2106=1.17108。(3)因为菌落可能由1个或多个细菌连在
6、一起生长而成,所以实际活菌数量要比测得的数量多。答案:步骤:稀释涂布平板(1)D(2)1.17108三、分解纤维素的微生物的分离纤维素分解菌的筛选 即时训练3有些微生物能合成纤维素酶,通过对这些微生物的研究和作用,使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基,成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题。(1)培养基中加入的化合物A是 ,为微生物的生长提供 ,这种培养基属于 培养基。(2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物,向培养基中加入 。(3)在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前,可用液体培养基培养,增加微生物的浓
7、度。为获得纯净的菌株,常采用平板划线的方法进行接种,此过程所用的接种工具是 ,操作时采用 灭菌的方法;还可用 的方法接种。(4)实验结束后,使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉,这样做的目的是。答案:(1)纤维素 碳源 选择(2)刚果红(3)接种环 灼烧 稀释涂布平板(4)防止造成环境污染葡萄糖发生这种反应。纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素,从而使菌落周围形成透明圈。(3)获得纯净的菌株有两种方法,即平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线操作时所用的接种环,每次接种之前都要灼烧,这是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污
8、染环境和感染操作者。(4)实验结束后,使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉,这样可防止造成环境污染。解析:(1)纤维素酶能将纤维素水解成葡萄糖,为微生物的生长提供营养,同样,也可以为人类所利用。要筛选到能产生纤维素酶的微生物,应用选择培养基,在培养基中加入纤维作唯一的碳源,能在此培养基中存活的微生物就是能产生纤维素酶的微生物。(2)刚果红可以和像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,而不与水解后的纤维二糖和考点一 微生物的实验室培养1.培养基(1)种类:按培养基的物理性质分类。液体培养基:配制成的液体状态的基质,一般用于生产。固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂(如琼脂),配制成的固体状态的
9、基质,琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一。(2)培养基配方及营养要素。基本营养要素:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。条件结果常用的方法消毒 较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌 强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌2.无菌技术(1)消毒和灭菌的区别。(2)无菌技术具体操作。对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等
10、进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。3.纯化大肠杆菌以及菌种的保藏(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基:计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(2)纯化大肠杆菌。原理:在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个的菌落,这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。方法:平板划线法、稀释涂布平板法。(3)菌种的保藏。短期保存:固体斜面培养基上4 保存,菌种易被污染或产生变异。长期保存:-20 甘油管在冷冻箱中保藏。易错提示酒精消毒时,70%的酒精杀菌效果最好,原因是:浓度过高,使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜,乙醇分子
11、不能渗入其中;浓度过低,杀菌力减弱。【例1】回答下列问题。(1)在大肠杆菌培养过程中,除考虑营养条件外,还要考虑 、和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、等优点,因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中,为防止杂菌污染,需对培养基和培养器皿进行 (消毒、灭菌);操作者的双手需进行清洗和 ;静止空气中的细菌可用紫外线杀灭,其原因是紫外线能使蛋白质变性,还能 。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数,要想使所得估计值更接近实际值,除应严格操作、多次重复外,还应保证待测样品稀释的 。(4)通常,对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征
12、对细菌进行初步的 。(5)培养大肠杆菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是。(6)若用大肠杆菌进行实验,使用过的培养基及培养物必须经过 处理后才能丢弃,以防止培养物的扩散。解析:(1)大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点,培养过程中,除考虑营养条件外,还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(2)灭菌是用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,所以对培养基和培养皿进行灭菌;消毒是用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物,操作者的双手需要进行清洗和消毒,紫外线能使蛋白质变性,还能损伤DNA的结构。(3
13、)稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养,应保证样品稀释的比例适合。(4)对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。(5)培养大肠杆菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生。(6)因为有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素,并可能导致肠管出现严重症状,使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃,以防止培养物扩散。答案:(1)温度 酸碱度 易培养 生活周期短(2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构(3
14、)比例合适(4)鉴定(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生(6)灭菌1.选择合适的培养基(1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基。培养基种类 特点用途选择培养基 培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素;用尿素为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌)考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基种类 特点用途鉴别培养基 根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物,如可用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳
15、制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)(2)分离分解尿素的细菌的培养基即为选择培养基。培养基中的氮源只有尿素,理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。2.统计菌落数目的方法(1)直接计数法。原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。方法:用计数板计数。缺点:不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)。原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长着一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作。a.设置重复组,增强实验的说服力与准确性。b.为了保证结果准确,一般选择菌落
16、数在30300的平板进行计数。计算公式:每克样品中的菌株数=C/VM,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。3.细菌分离与计数的实验流程土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数。易错提示培养分解尿素的微生物的培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素为氮源,缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长繁殖,受到抑制,所以,用该培养基能够筛选出分解尿素的微生物。【例2】尿素是一种重要的农业肥料,但若不经细菌的分解,就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多,同学们试图探
17、究土壤中微生物对尿素是否有分解作用,设计了以下实验,并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示,实验步骤如下图所示。请分析回答问题。KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10 g尿素1 g琼脂15 g将上述物质溶解后,用自来水定容到1 000 mL(1)此培养基能否用于植物组织培养?,理由是。(2)培养基中加入尿素的目的是 ,这种培养基属于 培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的 和 ,实验需要振荡培养,原因是。(4)转为固体培养时,常采用 的方法接种,获得单菌落后继续筛选。(5)下列材料或用具中:培养细菌
18、用的培养基与培养皿;玻棒、试管、锥形瓶和吸管;实验操作者的双手。需要灭菌的是:;需要消毒的是:。(填序号)(6)在进行分离分解尿素的细菌实验时,A同学从培养基上筛选出大约150个菌落,而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有()。(填序号)由于土样不同 由于培养基污染 由于操作失误 没有设置对照(7)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 ,细菌合成的 将尿素分解为氨,pH增高,使指示剂变红色。解析:(1)微生物与植物生长所需的营养不完全相同,培养微生物的培养基不能用于植物组织培养。(2)培养基中加入尿素作氮源,分解尿素的微生物可生长,这种培养基属于选择培养基。(3)“目的
19、菌”生长所需的氮源和碳源分别来自尿素和葡萄糖。实验需要振荡培养增加溶氧量。(4)在固体培养基上接种用涂布平板法或平板划线法。(5)灭菌要彻底消灭微生物及其芽孢,如和。实验操作者的双手要消毒。(6)A同学从培养基上筛选出的菌落与其他组相比,原因可能是由于土样不同;由于培养基污染;由于操作失误。与设置对照无关。(7)由于细菌合成的脲酶将尿素分解为氨,pH增高,故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂将变红。选目的菌 选择(3)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气(4)涂布平板法(划线法)(5)和(6)(7)酚红指示剂 脲酶答案:(1)不能 缺少植物激素(或缺少植物需要的各种营养)(2)筛1.筛选原理
20、(1)(2)考点三 分解纤维素的微生物的分离即:可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。2.实验流程(1)土壤取样:富含纤维素的环境。(2)选择培养:用选择培养基培养,以增加纤维素分解菌的数量。(3)梯度稀释。(4)涂布平板:将样品涂布于鉴别培养基上。(5)挑选产生透明圈的菌落。方法先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应在倒平板时就加入刚果红过程培养基长出菌落覆盖CR溶液(质量浓度为1 mg/Ml)倒去CR溶液加入NaCl溶液(物质的量浓度为1mol/L)倒掉NaCl溶液产生透明圈配制CR溶液(质量浓度为10 mg/mL)灭菌按照1 mLCR溶液/200 mL培养基比例混匀倒平板培养透明圈优点
21、显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作简便,不存在菌落的混杂问题缺点操作烦琐,加入刚果红会使菌落之间发生混杂由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含淀粉类物质,可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈,即假阳性反应有些微生物具有降解色素的能力,它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显透明圈,与纤维素分解菌不易区分 易错提示对分离的纤维素分解菌作进一步鉴定的原因形成透明圈的菌落与其他物种菌落出现混杂现象,产生透明圈的菌落可能是能产生淀粉酶的微生物,也可能是能降解刚果红的菌种,所以需要进一步确定。【例3】纤维素酶可以通过微生物发酵生产,为了提高纤维素酶的产量,请你设计一个实验,利用诱变育种的方法,获得
22、产生纤维素酶较多的菌株。(1)写出实验步骤:将培养好的生产菌株分成两组,。制备含有 的固体培养基。(2)预期实验结果及结论:诱变组中菌落周围的透明圈比对照组 ,说明。诱变组中菌落周围的透明圈与对照组,说明。诱变组中菌落周围的透明圈比对照组小,说明。(3)若想获得纯净的高产菌株,需进行 或 操作。维素酶的菌株,先进行诱变处理,由于突变是不定向的,所以要进行筛选。实验分为两组,实验组用诱变剂处理,对照组不作处理。要检测纤维素分解菌产生纤维素酶的能力,应用含纤维素的鉴别培养基,根据形成的透明圈的大小,来判断产酶能力的高低。整个过程中,注意对照组和实验组的其他条件完全相同。(2)预期实验结果,诱变组和对照组相比,透明圈大小可能相同,可能较大,可能较小,所以需要分情况讨论。(3)一般初次分离得到的都不是纯净的细菌,需进一步纯化。解析:(1)设计实验要遵循对照原则和单一变量原则,且要得到高产纤培养基上,同时接种对照组(未作处理)的菌株,把它们置于相同的适宜条件下培养 一段时间后,取培养基用刚果红染色,观察记录菌落周围透明圈的大小情况(2)大诱变育种获得了高纤维素酶产量的菌株 相同 诱变育种没有使菌株发生变化 诱变育种获得了低纤维素酶产量的菌株(3)平板划线 稀释涂布平板答案:(1)一组用一定剂量的诱变剂处理,另一组不作处理作为对照纤维素 把诱变组的大量菌株接种到多个含有纤维素的固体
