1、1、分离生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2、蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质新课引入蛋白质的提取3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种特性，作用结果是什么被破坏？变性、变性，空间结构4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富（红色）便于提取血红蛋白一.基础知识（一）凝胶色谱法1、别名：分配
2、色谱法根据被分离物质的相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来分离蛋白质的有效方法.2、概念：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道3、凝胶色谱法的原理分子筛效应分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢5、具体过程相对分子质量的大小4、依据的特性洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收 集大分子收集
3、小分子（二）缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变1、作用2、缓冲溶液的配制通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液思考：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)（三）电泳：1、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程2、原理许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小
4、，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动3、常见方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4、实例十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量应用蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素原理 SDS作用为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS,SDS能与各种蛋白质形成复合物。SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小二、实验操作样品处理粗分离纯化纯度鉴定1、样品处理（一）蛋白
5、质提取和分离步骤血液组成（二）操作过程血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90）两个a肽链两个一肽链四个亚铁红素基团成分每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色组成及作用本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白选材(1)红细胞的洗涤洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少洗涤操作A、采集血样B、低速短时间离心（为什么）速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆D、盐水洗涤：用五倍体
6、积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤E、低速离心（低速短时间）F、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净(2)血红蛋白的释放加蒸馏水（使红细胞大量吸水胀裂）到原血液体积，再加40体积的甲苯（溶解红细胞的细胞膜），置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液过程将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次用滤纸过滤
7、，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体分离取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时2、粗分离除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液过程透析目的（透析）（透析）3、纯化（凝胶色谱操作）（1）凝胶色谱柱的制作取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底注意事项：
8、顶塞的制作打孔安装玻璃管组装将上述三者按相应位置组装成一个整体（2）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液凝胶的前处理凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀注意：2、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空
9、隙思考:你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果在装填过程中要注意些什么问题呢？2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时洗涤平衡（3）样品加入与洗脱调节缓冲液面滴加透析样品吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口样品渗入凝胶床洗脱加样
10、后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）讨论：答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能注意：正确的加样操作1、不要触及破坏凝胶面2、贴壁加样3、使吸管管口沿管壁环绕移动1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红
11、蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？（四）鉴定（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定血红蛋白纯度目的观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分
12、层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气
13、泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少B 分子的大小C 肽链的多少D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长D 防止血液凝固
