1、第1讲基因工程1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体三种基本工具3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质5.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质6.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程7.实验：DNA的提取和鉴定1.基因的结构与功能(生
2、命观念)2.基因工程的操作流程图及蛋白质工程的流程图等(科学思维)3.基因工程的应用和蛋白质工程(科学探究)4.正确看待转基因生物与环境安全问题(社会责任) 基因工程的基本工具及基本程序1基因工程的概念(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(2)优点。与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。2基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。来源：主要来自原核生物。特点：具有专一性，表现在两个方面：识别双链DNA分子的某种特定核苷
3、酸序列。切割特定核苷酸序列中的特定位点。作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。结果：产生黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶。种类Ecoli_DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键(3)载体。种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。质粒的特点运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。3基因工程的基本程序(1)目的基因的获取。从基因文库中获取。人工合成利用PCR技术扩增。(2)基因表达载体的构建基因工程的核心。目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因
4、能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成。(3)将目的基因导入受体细胞。转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。转化方法。生物类型植物动物微生物受体细胞体细胞受精卵大肠杆菌或酵母菌等常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法感受态细胞法(4)目的基因的检测与鉴定。方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无分子水平分子杂交技术目的基因是否转录抗原抗体杂交目的基因是否翻译抗虫或抗病接种实验是否具有抗虫抗病特性个体水平4PCR技术(1)原理：DNA双链复制。(2)条件。(3)过程(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子
5、，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。1基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。2载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
6、当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示。3基因工程操作的四个易错点(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。(4)启动子起始密码子，终止子终止密码子。启动子和终止子位于DNA片段上
7、，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。1非洲爪蟾核糖体蛋白基因可以与质粒重组，并且在大肠杆菌细胞中表达，其遗传学基础是什么？提示：非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒均具有相同的组成单位和双螺旋结构，且不同生物的密码子相同。2用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。提示：基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。考查基因工程的工具1青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tm
8、s基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图。(1)科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是_。(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用是_。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是_。(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，_是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是_。 (4)TDNA的作用是可以使_，并插入植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用_技术。(
9、5)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是_。解析(1)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法，因此，科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是农杆菌转化法。(2)图中结构P、T与基因的转录有关，即基因成功转录的保证，T为终止子，则P为启动子，它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是标记基因。 (3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，基因表达载体的构建是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两
10、端分别进行切割，这样做的好处是可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接。 (4)TDNA的作用是可以使目的基因进入植物细胞，并插入植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用DNA分子杂交技术。(5)冠瘿组织的生长与细胞的分裂和伸长等有关，由此推知冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进其生长。答案(1)农杆菌转化法(2)RNA聚合酶识别和结合的部位标记基因(3)基因表达载体的构建(或构建基因表达载体)可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接(4)目的基因进入植物细胞DNA分子杂交(
11、5)tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长基因工程的操作程序2真核生物基因中通常含内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。研究发现绿色木霉合成并分泌的环氧化水解酶可降解黄曲霉素B1。现有含绿色木霉的菌液，为获得环氧化水解酶，研究小组进行以下两种尝试：(1)方法一从含有绿色木霉的菌液中提取细胞的mRNA，在_酶的催化下，合成cDNA。以cDNA为模板，通过_技术大量扩增，获得目的基因。构建目的基因表达载体，导入大肠杆菌的体内。目的基因在大肠杆菌体内正常转录，但是翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性，需做进一步
12、的处理加工，原因在于_。(2)方法二提取绿色木霉的全部DNA，选用适当的_酶处理后，会获得一些小的DNA片段。选择一些合适的载体与获取的DNA片段构建基因表达载体。与从cDNA文库中获取目的基因构建表达载体所用载体相比，该载体组成不需要添加_成分。载体和这些DNA片段连接起来，导入受体菌的群体中储存。从这些受体菌的群体中筛选出含有目的基因的受体菌，分离出目的基因，将该目的基因和载体结合，通过_法导入大肠杆菌体内。该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于_。解析(1)以mRNA合成cDNA的过程为逆转录。以已知的cDNA为模板扩增目的基因可采用PCR技术。绿色木霉为真核生物
13、，合成并分泌的环氧化水解酶为分泌蛋白，而大肠杆菌为原核生物，细胞内无内质网和高尔基体，因此在其体内翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性。(2)由提取绿色木霉的全部DNA获取一些小的DNA片段需要用限制酶进行处理。从cDNA文库中获取目的基因中无启动子和终止子。将该目的基因导入大肠杆菌的方法为转化法。从基因组文库里分离出的该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于目的基因中存在内含子。答案(1)逆转录PCR环氧化水解酶是分泌蛋白，需要内质网和高尔基体加工(2)限制启动子、终止子转化目的基因中存在内含子3甘蔗黄叶综合征是一种由甘蔗黄叶病毒所引起的禾本科植物病毒，科学家通过甘蔗黄叶
14、病毒外壳蛋白基因(简称CP蛋白基因)转化植物来获得抗病转基因新品种。(1)首先从甘蔗黄叶综合症的病叶中提取RNA，此过程中为了防止RNA被分解，需加入_抑制剂，以提取的RNA为模板通过_获得cDNA。(2)对获取的cDNA进行PCR扩增，在此反应体系中，除了模板DNA、dNTP外，还需加入_，获得大量的cDNA需要在4 的低温下保存备用，原因是_。(3)将cDNA和质粒用同一种限制酶切割，产生相同的平末端，再用_将二者进行连接(填“EcoliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。在培养基上接种培养大肠杆菌作为受体细胞，同时加入一定量的CaCl2低温冷却液，目的是制备_细胞，其具有的特殊功能是
15、_。(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得_作为检测剂。解析(1)RNA酶可将RNA水解，因此为了防止RNA被分解，需加入RNA酶抑制剂；以RNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。(2)采用PCR技术扩增目的基因时的条件有模板DNA、dNTP、引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)；获得大量的cDNA需要在4的低温下保存备用，原因是高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性。 (3)DNA连接酶包括EcoliDNA连接酶、T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端。用CaCl2处理微生物细
16、胞可使其成为感受态细胞，其具有的特殊功能是能吸收周围环境中的DNA分子。 (4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)作为检测剂。答案(1)RNA酶逆转录(2)引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性(3)T4DNA连接酶感受态能吸收周围环境中的DNA分子(4)CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体) 基因工程的应用和蛋白质工程1植物基因工程(1)培育抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。(2)
17、抗病转基因植物：使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。(3)抗逆转基因植物：抗逆基因有抗旱基因、抗除草剂基因等。(4)利用转基因改良植物的品质：如提高玉米中某种氨基酸含量、延长番茄储存时间、培育新花色的矮牵牛等。2动物基因工程(1)提高动物生长速度：将外源生长激素基因转入动物体内，可以提高产量。(2)用于改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可以使转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。(3)用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与乳腺蛋白的启动子等调控组件重组在一起，培育乳腺生物反应器。(4)用转基因动物作器官移植的供体。3基因工程药品(1)受体细胞：多为原核细胞。原因是其
18、繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。(2)方式：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。(3)成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。4基因治疗(1)概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。(2)类型：体外基因治疗和体内基因治疗。(3)实质：正常基因的表达掩盖病变基因的表达，达到治疗疾病的目的。(4)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。5蛋白质工程(1)概念。以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。(2)
19、流程图。写出流程图中字母代表的含义：A转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。(3)蛋白质工程与基因工程的比较。区别。比较项目蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系。a蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。b基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。1利用转基因
20、技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？提示：药用蛋白基因没有转录或翻译。2研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程。提示：从预期蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列。3请简要写出从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功的设计思路。提示：取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，取等量长势一致的普通棉花植株接种等量棉铃虫作为对照组。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。基因工程的
21、应用1植物甲含有A基因，其编码的蛋白质中富含赖氨酸。科学家通过基因工程培育出的转基因玉米也能合成甲的富含赖氨酸的蛋白质，使玉米中赖氨酸的含量比原来提高30%。请回答：(1)在获取目的基因时，常从甲的细胞中提取富含赖氨酸的蛋白质的mRNA，并利用mRNA人工合成cDNA。上述人工合成cDNA的过程称作_；与甲细胞中的A基因相比，cDNA中不具有调控基因表达的_等组件。(2)在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的TDNA中，原因是_。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共同培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，这种处理的作用是_。(3)在获得转基因玉米后，可采用核酸分子杂交
22、技术对玉米细胞中是否存在A基因的转录产物进行检测，检测时需用_制作基因探针。(4)实验发现，某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，而用乙的体细胞离体培养所产生的植株100%富含赖氨酸。将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程称为_。若乙中的A基因都能表达，且不考虑突变和染色体交叉互换，乙自交子代富含赖氨酸的个体占15/16，原因是_。解析(1)根据题意分析，人工合成cDNA的过程是以RNA为模板合成DNA的过程，为逆转录过程；与A基因相比，人工合成的cDNA中不含启动子、终止子和内含子。(2)农杆菌细胞中的Ti质粒上的TDNA(可转移DNA)能进入玉米细胞并整
23、合到玉米染色体DNA上，因此在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的TDNA中。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共同培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，以吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染。(3)检测A基因(目的基因)可以用DNA分子杂交法，该过程需要用含A基因的DNA片段(或A基因)制作基因探针。(4)将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程为植物组织培养。根据题意分析，将某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，即只有1/16(1/41/4)的个体不富含赖氨酸，相当于两对杂合子的自交实验，说明乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所
24、产生的配子中只有3/4的配子含A基因。答案(1)逆转录启动子、终止子、内含子(2)TDNA能进入并整合到玉米染色体DNA上吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染(3)含A基因的DNA片段(或A基因)(4)组织培养乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因2(2021广东综合测试)棉花田中喷洒含草甘膦的除草剂，在除去杂草的同时也会损伤棉花植株。为解决这一问题，科研人员将抗草甘膦基因导入棉花细胞，获得转基因棉花。其中，构建的双抗草甘膦基因表达载体部分示意图如下。回答下列问题。注：箭头代表转录方向。(1)构建上述基因表达载体所需要的工具酶有_。根据基因表达载体的结构组成
25、分析，RBSC是_，其功能是_。(2)为检测抗草甘膦基因是否导入棉花细胞，可采用_进行检测。除此以外，还可以使用PCR技术。PCR 反应体系中，应加入待测棉花细胞的_、抗草甘膦基因的_、_、dNTP等物质，若扩增出现阳性反应，则说明导入成功。(3)筛选获得成功转化的棉花细胞，将其转入含有营养物质_、_的培养基中诱导培养和筛选，从而获得抗草甘膦基因的转基因棉花植株。(4)研究成果显示，成功转化双抗草甘膦基因表达载体的棉花抗性较转化单抗草甘膦基因表达载体的高，合理解释是_。答案(1)限制酶和DNA连接酶启动子RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录的进行(2)DNA分子杂交基因组DNA特异性引物(3
26、)植物激素(一定浓度的)草甘膦(4)双抗草甘膦基因表达载体中抗草甘膦基因数目多，可获得基因表达产物多，因此抗性强蛋白质工程及应用3香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白，通过一定的方法获得新HMGS基因，然后将其导入番茄细胞，获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄，该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题：(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径：_。(2)如图的4种质粒中，E表示EcoR 的切割位点，将这些质粒用EcoR 充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为_个，接着将新HMGS基因
27、分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合，编号为1、2、3、4组，结果发现除第_组外，其余3组都有含新HMGS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外，还包括_及复制原点。(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒，则图示E所处的位置在Ti质粒上的_，将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞，成功获得含新HMGS基因的转基因番茄，将其果实色素提取后，用_法分离，可发现滤纸条上_(填颜色)的条带比第4组的宽。解析(1)蛋白质工程的原理为从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，由此可写出获得新
28、HMGS基因的基本途径：从s359a蛋白的功能出发设计s359a蛋白的结构将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列。(2)图中质粒1、2、3、4上的限制酶EcoR 切割位点分别为3、2、1、0，用EcoR充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为3、2、1、0。第4组无EcoR 切割位点，因此无法构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子以及复制原点。(3)Ti质粒上的TDNA可将目的基因转移到受体细胞且整合到受体细胞染色体的DNA上。色素的提取方法为纸层析法。新HMGS基因导入番茄细胞，获得的类胡萝卜素增加，因此
29、滤纸条上橙黄色和黄色的条带比第4组的宽。答案(1)从s359a蛋白的功能出发设计s359a蛋白的结构将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列或从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)(2)3、2、1、04启动子和终止子(3)TDNA纸层析橙黄色和黄色 DNA的粗提取与鉴定1基本原理(1)DNA的粗提取：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。(2)DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异比较项目DNA蛋白质溶解性2 mol/L NaCl溶液中溶解析出
30、0.14 mol/L NaCl溶液中析出溶解酒精溶液中析出溶解耐受性蛋白酶无影响水解高温80 以上变性不能耐受6080 的高温(3)DNA的鉴定：DNA二苯胺蓝色。2实验流程材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞加蒸馏水用玻璃棒搅拌用纱布过滤收集滤液去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质DNA的析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管在沸水中加热5 min，溶液变成蓝色明确实验中三种重复操作的目的
31、和作用1加2次蒸馏水(1)加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破。(2)加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出。2用纱布过滤3次(1)过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液。(2)滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)。(3)过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液。3用4次NaCl溶液(1)用2 mol/L的NaCl溶液，过滤除去不溶的杂质。(2)用0.14 mol/L的NaCl溶液，析出DNA。(3)用2 mol/L的NaCl溶液，溶解DNA。(4)用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状
32、物用于DNA的鉴定。下图为某兴趣小组开展“DNA的粗提取与鉴定”实验过程中的一些操作示意图。 ABCDE正确的操作顺序是什么？说明理由。提示：CBEDA。DNA粗提取时，先用蒸馏水处理鸡血细胞，使其吸水涨破，释放DNA，然后过滤，去除杂质，获得滤液，接着加入2 mol/L的NaCl，再加入蒸馏水，使其析出，将析出的DNA溶解于2 mol/L的NaCl，最后加入95%的冷酒精，析出纯净的DNA，即正确的操作顺序是CBEDA。考查DNA的粗提取与鉴定的原理及操作流程下图是某中学生物兴趣小组进行的DNA粗提取实验，其中SDS(一种表面活性剂)除了能瓦解细胞膜和核膜，还能与脂质和蛋白质结合。当SDS遇
33、到钾离子时，钾离子可以置换SDS中的钠离子，产生不溶于水的PDS沉淀。请回答下列问题：(1)实验中，向剪碎的猪肝中加入食盐的主要作用是_。将猪肝匀浆放入65 水浴锅中水浴10 min以除去部分杂质的主要实验原理是_。(2)方法一的步骤中加入洗涤剂的作用是_。方法三的步骤中，离心后应取_。(3)方法一、二获得的絮状物均带黄色，从DNA在细胞中的存在形式分析，杂质分子最可能是_，可用_试剂鉴定。(4)要比较三种方法获得的絮状物中DNA含量，请写出实验思路：_。解析(1)DNA粗提取的原理主要有DNA分子在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低而蛋白质等杂质在此浓度中溶解度比较大；蛋白质在高
34、于60 C溶液中容易变性、沉淀，而DNA能耐受较高的温度；DNA不溶于酒精，而蛋白质等物质可溶。(2)根据题意，SDS与钾离子发生转换反应，产生PDS沉淀，因此可以通过沉淀、离心，去除实验中加入的SDS，在离心后取含有DNA的上清液。(3)DNA在真核细胞中主要存在于细胞核内，与蛋白质结合形成染色体，因此，与DNA分子结合较牢的杂质最主要的是蛋白质。蛋白质可用双缩脲试剂进行鉴定。(4)由于DNA遇二苯胺在水浴加热条件下发生反应，出现蓝色，并且蓝色深浅与DNA含量呈正相关，因此实验中可以通过将等量的三种絮状物溶解，加二苯胺试剂并水浴加热，比较蓝色深浅，实现对三种絮状物中DNA含量的比较。答案(1
35、)溶解DNA蛋白质在65 高温下会变性，而DNA能耐受这一温度(2)瓦解细胞膜和核膜上清液(3)蛋白质双缩脲(4)分别取等量的三种絮状物，并用等量的2 mol/L NaCl溶液溶解；再向各试管中加入等量的二苯胺试剂并水浴加热；比较三支试管中蓝色的深浅真题体验| 感悟高考淬炼考能1(2020山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_，重组载体进入水稻细
36、胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列_(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总 cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是_。(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如下图所示，据图推测糯性最强的品系为_，原因是_。解析(1)限
37、制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合
38、成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。答案(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶转化(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合不发生编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
39、(3)逆转录(或反转录)引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(4)品系3品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强2(2019全国卷)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_和_。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是_。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_。(3)目前在PCR反应中使用Ta
40、q酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_。解析(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至9095 进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至9095 ，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。答案(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至9095 氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活3(2018全国卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核
41、糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2参与的_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。解析(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中
42、并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程
43、中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶4(2018全国卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种
44、限制酶，这两种酶是_。使用这两种酶进行酶切是为了保证_，也是为了保证_。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_移入牛的_中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析(1)据图示信息分析：将L1GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1GFP融合基因的完整，
45、又能保证L1GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。答案(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞 (4)核DNA5(2017全国卷)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1
46、)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。解析(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提
47、取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传。(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。答案(1)嫩叶组织细胞易破碎防止RNA降解(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子(4)磷酸二酯键(5)目的基因的转录或翻译异常
