1、葡萄中酵母菌的筛选及菌株鉴定冯炘摘要：以葡萄为菌源，分别在葡萄发酵的前期、中期、后期取一定的发酵液进行稀释涂布，后经过 YPD 培养基对涂布后的菌株进行分离纯化。将分离纯化后的菌株进行 WL 培养基聚类分析及生理生化实验，并用 TTC 培养基对菌株进行初筛，选取红色最深的菌株作为复筛菌株。对复筛菌株进行发酵性能测定筛出发酵性能较好菌株，编号为 Y1，并对此菌株进行分子生物学鉴定。Y1 菌株的 26S r DNA 鉴定结果表明其为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），此菌株为后续发酵实验提供了基础。Abstract：With grape as the source of
2、bacteria，a certain fermentation broth wasdiluted and coated in the early，middle，and late stages of grapefermentation，and the coated strain was separated and purified by YPD medium.The isolated and purified strains were subjected to WL culture clusteranalysis and physiological and biochemical experim
3、ents，and the strains werepre-screened with TTC medium.The reddest strain was selected as the re-screening strain.The fermentation performance of the double-screened strainwas determined，and the strain with better fermentation performance wasscreened out，and the number was Y1，and molecular biology id
4、entificationwas performed on the strain.The 26S r DNA identification of Y1 strain showedthat it was Saccharomyces cerevisiae，which provided a basis for subsequentfermentation experiments.关键词：酵母菌;分离鉴定;发酵特性;生理生化0引言酵母菌是一类被广泛应用在发酵工业中的单细胞真菌，它广泛分布在自然界各处1。酵母菌是以芽孢繁殖为主的单细胞真核微生物，大部分的酵母菌是腐生的，生活在含糖量较高、偏酸性的环境中，如
5、生长在花朵、植物果实表面等，还有很大一部分生活在蔬菜园、水果园园的土壤中;小部分为寄生的2，3。酵母菌的生长繁殖速度较快、也比较容易分离纯化。酵母常用于酿酒、食品制作等，是人类最早应用于生活的微生物之一。随着人们对酵母菌研究的逐步深入，酵母菌也逐渐被应用在酶制剂、物料生产、医药工业以及环境保护等各个方面。目前，酵母菌主要应用在构建基因工程菌、酿酒及其他发酵产业。酿酒酵母可以发酵不同来源的植物碳水化合物，例如：水果汁等。葡萄果实甜度高、颗粒饱满、营养丰富，适合微生物的生长繁殖，酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生长较快;在缺
6、氧条件下，细胞进行无氧酵解，在酶的作用下，葡萄糖代谢为丙酮酸，丙酮酸在无氧条件下，在细胞内丙酮酸脱羧酶和乙醛脱氢酶作用下，生成乙醇和二氧化碳4-6。微生物菌株是生产乙醇的主力军，在以木质纤维素为原材料的发酵生产乙醇的工艺中，酵母菌的筛选显得格外重要7-10。本文以葡萄为菌源，通过稀释涂布、YPD 分离纯化、WL 培养基聚类分析、生理生化、TTC 培养基初筛及菌株发酵性能测定得到发酵性能较高的菌株，为之后课题组对秸秆发酵液产乙醇的工艺提供了基础。1材料与方法1.1 培养基与试剂1.1.1 培养基YPD 培养基：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母浸粉 10g，琼脂粉 25g，蒸馏水 1000mL
7、，pH 自然，115灭菌 20min。TTC 培养基：上层：葡萄糖 5g，2，3，5-三苯基氯化四氮唑 0.5g，琼脂 15g、蒸馏水1000mL;下层：YPD 琼脂培养基，121灭菌 20min。WL 培養基：葡萄糖 50g，蛋白胨 5g，酵母浸粉 5g，氯化钾 0.425g，磷酸二氢钾0.55g，氯化钙 0.125g，氯化铁 0.0025g，硫酸锰 0.0025g，硫酸镁 0.125g，溴甲酚绿0.022g，琼脂粉 20g，蒸馏水 1000ml，pH 5.5，121灭菌 20min。活化培养基：葡萄糖 20g，蛋白胨 20g，酵母浸粉 10g，蒸馏水 1000mL，pH 自然，115灭菌
8、20min。发酵培养基：葡萄糖 40g，蛋白胨 20g，酵母浸粉 10g，蒸馏水 1000mL，pH5.0，115灭菌 20min。1.1.2 实验试剂葡萄糖，蛋白胨，酵母浸粉，琼脂粉，2，3，5-三苯基氯化四氮唑，溴甲酚绿，KH2PO4，KCL，CaCL2，MgSO4，FeCL3，MnSO4，NaNO3，NaCL，CaCO3 等均为分析纯。1.1.3 菌株来源本研究的菌株分离自葡萄自然发酵的前期、中期和后期。1.2 方法1.2.1 酵母菌的分离与纯化称 50g 新鲜成熟度好的葡萄，捣碎，放入 50mL 已灭菌的蒸馏水中，30静置培养。分别于发酵的初、中、后期取一定浓度的发酵汁 0.1mL，梯
9、度稀释至 10-7 倍均匀涂布于YPD 琼脂培养基，27培养 48h。随机挑取 15-20 个单菌落，以划线方式在 YPD 平板上分离纯化。此过程重复 3-5 次。菌株于 4冰箱保存。1.2.2 菌株的 WL 聚类分析将分离菌株划线接种于 WL 培养基上，28恒温培养箱培养 24h，观察菌落形态及颜色，可对照酵母菌的特征及鉴定手册对菌株进行初步分类鉴定11。1.2.3 菌株的生理生化实验根据酵母菌的特征与鉴定手册可知，酵母菌的生理生化实验主要包括：氮源同化、碳源同化以及糖发酵实验 12。1.2.4 TTC 筛选法将保藏的酵母菌株用 YPD 液体培养基活化后，一一对应涂布于 TTC 底层培养基上
10、，在 28 恒温箱中培养 48 h。待灭菌后的上层培养基已冷却为 4550时倒在底层培养基上，于 30无光条件下培养 2-4h 后，取出立即观色，根据菌落呈色情况挑选菌种。1.2.5 酵母菌发酵性能测定酵母菌在无氧条件下通过呼吸作用，将糖类转化为乙醇，并放出二氧化碳，以上过程可表示为 C6H12O62C2H5OH+2CO2。由此式可知，通过 CO2 产生的量可以对菌种的发酵能力进行推断，继而表征发酵效率13。配制 100mL YPD 发酵培养基，按 10%的接种量接入种子液，同时将未接种的发酵培养基作为对照，称重后放入培养条件为 28、120r/min 的摇床培养箱中，发酵过程中每隔12h 取
11、出称重，直至发酵液前后质量差与对照组质量差相当，即认为发酵终止。计算排气前后重量差，即 CO2 释放量。1.2.6 菌株的分子生物学鉴定将菌种送宝生物工程（大连）有限公司进行 26s rDNA 区扩增及序列测定14-16。根据测序结果，通过 NCBI 核酸序列数据库中 BLAST 进行相关序列搜索进行同源序列搜索，比较测序菌株与已知酵母菌相应序列的相似程度 17。2结果与分析2.1 分离纯化结果通过数代的分离纯化，共获得能在 YPD 培养基上良好生长的菌株 9 株将其统一编号为C1-C9，酵母菌形态描述见表 1。2.2 镜检结果将菌株一一对应制作成水玻片，再将制好的装片放在显微镜下进行观察，由
12、低倍镜到高倍镜，镜检结果描述见表 2。由表 2 可知：初筛得到的菌株细胞形态大多为椭圆形或圆形，另外还有少数呈柠檬形，皆为多端出芽的無性繁殖，无假菌丝出现且有子囊孢子。2.3 WL 培养基聚类生长于 WL 培养基上的酵母菌的菌落形态和颜色会因为种类不同而出现较明显的区别18。WL 培养基菌落形态见表 3。依据表 3 的菌落颜色及形态与酵母菌：特征与鉴定第三版中的菌株特征对照，初步鉴定出 C1 为中间型酒香酵，C2 为葡萄汁有孢汉逊酵母，C3、C6、C8 为酿酒酵母菌，C4为戴尔有孢圆酵母19，20。剩余菌株暂无鉴定结果。2.4 生理生化分析由表 4 可知，9 株菌都可以利用葡萄糖进行发酵，几乎
13、不能利用阿拉伯糖和木糖进行发酵。至于其它几种糖，分别呈阳性、弱阳性、阴性。由表 5 可知，9 株菌株均可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖为碳源的液体培养基中生长，呈阳性;至于乳糖、阿拉伯糖、木糖则呈阳性、弱阳性、阴性等。由表 6 可看出，这 9 株不同菌株都可以在以蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵或尿素的培养基上生长，且生长状况良好，呈阳性。2.5 TTC 筛选结果TTC 平板显色结果如图 1 所示。比较图 1 中的显色结果可知，C2、C5、C7 培养基中菌落呈现深红色，其余的则偏粉红色和浅白色。将显色反应更为明显即显色后颜色更为深红的菌株划线分离后并将其分别重新编号得到 Y1、Y2、Y3，筛得的 3 株菌株即
14、为发酵产乙醇能力较强的菌株。2.6 CO2 释放量测定由图 2 可知，3 株酵母菌的 CO2 释放量均随着发酵时间的增加而逐渐减少，即在发酵过程的前 24h 时，发酵效率最大，随后产生的 CO2 含量减少，即单位时间发酵产生的乙醇含量减少。因此前 24h 的 CO2 释放量作为发酵效率高低的比较指标。图中 Y1 在 24h 时的CO2 释放量明显高于其它两株菌，初步推断 Y1 菌株的发酵效率高于其它两株。2.7 分子生物学鉴定结果使用 MEGA-X 软件进行多序列对位排列，并采用 N-J 方法构建系统发育树，分离菌株Y1 与标准菌株 Saccharomyces cerevisiae NRRL
15、Y-12632 的同源性超过 99%，表明其具有较近的亲缘性。菌株 Y1 鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。3结论通过 YPD 培养基分离纯化出 9 株酵母菌，分别编号为 C1-C9。对 9 株酵母菌进行碳源同化、氮源同化和糖发酵实验。结果表明，9 株酵母菌都可以利用葡萄糖进行发酵，几乎不能利用阿拉伯糖和木糖进行发酵，且均可在以葡萄糖、蔗糖和半乳糖为碳源的液体培养基和以蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵或尿素的培养基上生长，生长状况良好，呈阳性。通过 WL 培养基聚类分析初步判断 C3、C6、C8 为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、C4 为戴尔
16、有孢圆酵母（Torulaspora debrueckii）、C2 为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），其它菌株暂无分类结果。通过 TTC 培养基筛选出 3 株乙醇高产菌株，重新命名为 Y1、Y2、Y3。通过 CO2 释放量测定表明 Y1 的发酵性能最。通过对 Y1 菌株的分子生物学鉴定表明，分离菌株 Y1 与标准菌株的同源性超过 99%，表明其具有较近的亲缘性，菌株 Y1 鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。参考文献：1杨清香，王哲.酵母菌在自然界中的生态分布及功能J.环境科学与技术，2009（4）：92-97.2崔小亮，邵小兵，钟
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