1、扁蒴藤素对肺纤维化模型小鼠肺组织形态及转化生长因子-1、-平滑肌肌动蛋白表达的影响蒋金桃 崔国良 冯小可 甘可 谈文峰 张前德摘要：目的观察扁蒴藤素对肺纤维化模型小鼠肺组织形态及转化生长因子（TGF）-1、-平滑肌肌动蛋白（-SMA）表达的影响，探讨其作用机制。方法采用氣管内注射博来霉素溶液制备小鼠肺纤维化模型。将 32 只雄性C57BL/6J 小鼠随机分为正常组、模型组、扁蒴藤素组及吡非尼酮组，每组 8只。正常组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射，扁蒴藤素组给予 1 mg/kg 扁蒴藤素溶液腹腔注射，吡非尼酮组给予 50 mg/kg 吡非尼酮溶液腹腔注射。给药体积 10 mL/kg，每日 1
2、次，连续 28 d。取肺组织行 HE 及 Masson 染色，评估小鼠肺组织病理学变化及胶原沉积;免疫组化和 Western bot 检测小鼠肺组织TGF-1 及-SMA 蛋白的表达。结果HE 及 Masson 染色显示，扁蒴藤素组小鼠肺泡炎及肺纤维化评分低于模型组（P0.05，P0.01）;免疫组化及 Westernblot 结果显示，与正常组比较，模型组小鼠 TGF-1 及-SMA 蛋白表达明显升高;与模型组比较，扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺组织 TGF-1 及-SMA 蛋白表达显著下降（P0.05，P0.01）。结论扁蒴藤素可改善模型小鼠肺纤维化，其机制可能与抑制 TGF-1 及-SMA
3、 蛋白表达有关。关键词：扁蒴藤素;肺纤维化;转化生长因子-1;-平滑肌肌动蛋白;小鼠中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1005-5304（2020）04-0041-05DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201910238Effects of Pristimerin on Morphology of Lung Tissue and Expressionsof TGF-1and-SMA of Pulmonary Fibrosis Model MiceJIANG Jintao1，2，CUI Guoliang1，2，FENG Xiaoke1，2，GAN Ke3，T
4、ANWenfeng1，2，ZHANG Qiande1，21.Institute of Integrated Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China;2.The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China;3.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，ChinaAbstract：Objective To explore the effects of
5、pristimerin on Morphology of lungtissue and the expressions of TGF-1 and-SMA of pulmonaryfibrosis model mice;To explore the action mechanism.Methods A mouselung fibrosis model was prepared by intratracheal injection ofbleomycin solution.32 male C57BL/6J mice were randomly divided intocontrol group，m
6、odel group，pristimerin group and pirfenidonegroup，with 8 mice in each group.The control and model groups weregiven the same amount of saline by intraperitoneal injection;thepristimerin group was given 1 mg/kg pristimerin by intraperitonealinjection，and the pirfenidone group was given 50 mg/kg pirfen
7、idoneby intraperitoneal injection.The administration volume was 10 mL/kgonce a day for 28 consecutive days.Lung tissues were obtained by HEand Masson staining to evaluate the pathological changes and collagendeposition in the lung tissues of mice.Immunohistochemistry andWestern blot were used to det
8、ermine the expressions of TGF-1 and-SMA proteins in the lung tissues of mice.Results HE staining andMasson staining showed that alveolar inflammation and pulmonary fiberscore in mice of pristimerin group were significantly lower than themodel group（P0.05，P0.01）.The results of immunohistochemistryand
9、 Western blot showed that compared with the control group，theprotein expressions of TGF-1 and-SMA in the model groupsignificantly increased;Compared with themodel group，the proteinexpressions of TGF-1 and-SMA in the lung tissues of mice in thepristimerin group and pirfenidone group were significantl
10、y reduced（P0.05，P正常 3 倍），但无肺结构损毁;3 分：肺泡间隔中度增厚（正常 3 倍），纤维组织增多;4 分：纤维组织团块形成面积小于镜下视野 10%，伴有轻度肺结构损害;5 分：纤维组织团块形成面积占镜下视野的 10%50%，伴有肺结构损害;6 分：纤维组织团块形成面积大于镜下视野的 50%，伴有明显肺结构损害;7 分：严重肺结构损毁，大片纤维化区域，蜂窝肺;8 分：满视野纤维组织。2.4免疫组化检测肺组织转化生长因子-1 和-平滑肌肌动蛋白表达取肺组织切片，二甲苯和梯度乙醇常规脱蜡，PBS 冲洗，滴加 H2O2 阻断内源性过氧化氢酶，柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，滴加山羊
11、血清覆盖组织，分别滴加一抗 TGF-1（1200）及-SMA（1500），放入湿盒，4 过夜。PBS 冲洗后分别滴加反应增强液、二抗，DAB 染色，苏木精复染，饱和碳酸锂返蓝，中性树脂封片。于正置显微镜 200 倍镜下观察 TGF-1 及-SMA 表达，拍照并记录。使用全自动 ImagePro-Plus 6.0 计算软件对免疫组化染色结果进行分析。2.5Western blot 检测转化生长因子-1 和-平滑肌肌动蛋白表达称取肺组织 20 mg，加入 300 g 蛋白裂解液，匀浆后抽提总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，按 30 g/孔上样，进行 SDS-PAGE 电泳，电泳结束后将凝胶移至PVD
12、F 膜上。5%脱脂奶粉 40 mL 室温封闭 2 h，TBST 洗膜 3 次10 min。按抗体说明书分别配制 TGF-1 一抗（11000）及-SMA 一抗（11000），4 孵育过夜。TBST 洗膜 3 次10 min。加入 HRP 标记二抗，室温慢摇孵育 2 h。TBST 洗膜 3 次10 min。化学发光试剂曝光蛋白印迹条带，Image Lab 软件分析实验结果，以 GAPDH 为内参，计算蛋白相对表达量。3统计学方法采用 GraphPad Prism 5.0 统计软件进行分析。实验数据以xs 表示，多组比较用方差分析。P0.05 表示差异有统计学意义。4结果4.1HE 染色结果正常组
13、小鼠肺组织结构清晰，肺泡形态正常，肺泡壁纤细，肺间质无炎症细胞浸润;模型组小鼠肺泡结构破坏严重，肺泡大量塌陷融合坏死，实变区肺泡壁增厚，有大量炎性细胞浸润;扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺泡结构基本完整，较少见肺泡塌陷或实变，肺泡腔可见少量炎性细胞浸润。见图 1。肺泡炎评分结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肺泡炎评分明显增加，差异有统计学意义（P0.01）;与模型组比较，扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺泡炎评分均明显下降，差异有统计学意义（P0.01）。见图 2。4.2Masson 染色結果正常组小鼠肺组织肺泡结构规则、整齐，有极少淡蓝色细丝状纤维沉积;模型组小鼠肺组织可见大量蓝色胶原沉积于肺泡间隔及
14、肺间质;扁蒴藤素组和吡非尼酮组较模型组小鼠肺组织蓝色胶原沉积均明显减轻。见图 3。肺纤维化评分结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺组织纤维化评分明显增加，差异有统计学意义（P0.01）;与模型组比较，扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺组织纤维化评分均明显下降，差异有统计学意义（P0.01）。见图 4。4.3免疫组化检测结果正常组小鼠仅支气管黏膜上皮细胞和成纤维细胞有少量 TGF-1 呈弱阳性表达，模型组小鼠肺泡上皮细胞、成纤维细胞、支气管黏膜上皮细胞广泛表达TGF-1;与模型组比较，扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺组织 TGF-1 表达明显降低（P0.05）。-SMA 蛋白主要表达于气管周围，以棕黄色染
15、色为阳性表达。与正常组比较，模型组小鼠肺组织-SMA 蛋白表达明显升高（P0.01）;与模型组比较，扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺组织-SMA 蛋白表达明显降低（P0.05）。见图 5图 8。4.4Western blot 检测结果与正常组比较，模型组小鼠肺组织 TGF-1 和-SMA 蛋白表达显著升高（P0.01）;与模型组比较，扁蒴藤素组和吡非尼酮组小鼠肺组织 TGF-1 和-SMA 蛋白表达明显降低（P0.05，P0.01）。见图 9、图 10。5讨论肺间质纤维化是结缔组织病的常见并发症，其主要临床表现为剌激性干咳和呼吸困难，发病机制目前尚不明确，最关键的病理特征被认为在于成纤维细胞的异常
16、增殖、成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞失调以及 ECM 大量沉积，最终导致肺功能衰竭12-13。近年来对肺纤维化机制的深入研究表明，TGF-1 在肺纤维化动物模型及肺纤维化患者中的表达显著升高14，被认为是肺纤维化发病及治疗中的关键分子。TGF-1 作为促纤维化因子，可引起成纤维细胞过度增殖活化，大量肌成纤维细胞产生，ECM 过度沉积，最终导致肺部组织结构重塑、肺功能受损15。研究表明，-SMA 是肌成纤维细胞活化的标记，胞浆中-SMA 表达使其具有收缩性，其与组织纤维化密切相关，同时其表达强度与肺纤维化程度呈正相关16-17。因此，-SMA 的表达水平可作为判定纤维化程度的一个间接指标，抑制
17、TGF-1 和-SMA 的表达，可改善肺纤维化的程度18。扁蒴藤素目前已成为治疗肿瘤、自身免疫及炎症性疾病的有效药物19。同时有文献报道，扁蒴藤素可通过下调 TGF-1 等相关纤维化基因改善心肌纤维化8。鉴于其在心肌纤维化中的作用，本实验采用小鼠气管内注射博来霉素方法模拟具有肺纤维化病理特点的动物模型，观察并探讨扁蒴藤素对肺纤维化小鼠的干预作用及其可能的作用机制。病理结果显示，模型小鼠肺组织结构破坏严重，肺泡间隔增厚，伴有大量炎性细胞浸润和胶原纤维增生，表明小鼠肺纤维化模型构建成功。经扁蒴藤素或吡非尼酮干预后，肺泡炎和纤维化评分均明显下降，提示扁蒴藤素可在一定程度上改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维
18、化，其作用效果与吡非尼酮相似。免疫组化及 Western blot 结果显示，与正常组比较，模型组小鼠 TGF-1 和-SMA 蛋白表达明显升高，这与既往研究报道20相一致，提示肺纤维化小鼠模型成功建立。经扁蒴藤素及吡非尼酮干预后，TGF-1和-SMA 蛋白表达较模型组均不同程度降低，且差异有统计学意义，提示扁蒴藤素改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化可能是通过抑制 TGF-1 和-SMA 蛋白表达实现的。目前临床应用吡非尼酮治疗肺纤维化虽具有一定的疗效，但尚未普遍推广。本研究发现扁蒴藤素与吡非尼酮具有相似的抗纤维化作用，但具体机制及相关不良反应还有待进一步研究。参考文献：1 ATZENNI F，G
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