1、第一部分微生物的利用本专题在模块中的地位和作用1、生物技术实践模块突出课程的基础性、实践性、技术性和时代性。2、本专题突出微生物培养技术在生物技术中的地位：操作基础（从古至今历史悠久，难度不大，是基本的实验研究）理论基础（为其他实验技术的发展提供理论依据）研究材料基础（微生物取材容易，分布广泛，是体现其他生物技术的很好的实验材料）3、具体活动内容 微生物的培养技术（培养、分离、技术的应用）技术是基本相同，但可供选择的微生物的物种具有多样性。（二）关键技术原理“细菌的划线分离法”赵金秋（西城教研）摄具体内容标准具体内容标准活动建议活动建议测定某种微生物的数量测定某种微生物的数量研究培养基对微生物
2、的研究培养基对微生物的选择作用选择作用用土壤浸出液进行细菌培养，用土壤浸出液进行细菌培养，仅以尿素为氮源，测定能生仅以尿素为氮源，测定能生长的细菌的数量长的细菌的数量一、课程标准对于本实验的要求实验2 分离以尿素为氮源的微生物实验2 分离以尿素为氮源的微生物（一）内容安排1.体现以微生物选择培养与计数为核心的微生物实验操作技术2.体现生物学原理的应用二、课程实验内容的安排及思考实验2 分离以尿素为氮源的微生物（二）教材中实验内容安排1使用专一的培养基（含有尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）2使用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应3说明测定细菌数量的原理与方法二、课程实验内容的安排及思
3、考实验2 分离以尿素为氮源的微生物 培养基的配制和灭菌操作 微生物培养的相关知识（或布置学生自学）：如选择培养基、涂布分离法等。设计实验方案。菌液制备、涂布分离、微生物培养（学生操作）（三）整体教学规划的建议三、实验教学具体技术操作问题实验2 分离以尿素为氮源的微生物（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂1.设备及用品250mL三角瓶1个和100mL三角瓶2个有盖试管3支（1.515cm）和试管架培养皿4个超净台移液器玻璃刮刀酒精灯200mL烧杯1个实验2 分离以尿素为氮源的微生物（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂2.材料50mL70%乙醇100mL三角瓶中的配制好的25mL全营养LB固体培养
4、基，加上封口膜后灭菌待用100mL三角瓶中的配制好的25mL尿素固体培养基，加上封口膜后灭菌，待冷至60时，加入通过G6玻璃漏斗过滤（使之无菌）后的10mL尿素溶液，摇动混合均匀后待用3支有盖试管中均加入4.5mL蒸馏水后灭菌待用250mL三角瓶加入99mL蒸馏水，加封口膜后灭菌待用土样1g（在有哺乳动物排泄物的地方取得）。三、实验教学具体技术操作问题（二）实验流程基本原理实验2 分离以尿素为氮源的微生物（1）琼脂和琼脂糖 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：其主要成分
5、不能被微生物利用；可使培养基固化；不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。本实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。（2）酸碱指示剂尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解产生了NH3，溶液会呈碱性。（二）实验流程基本原理实验2 分离以尿素为氮源的微生物酸碱指示剂是用来指示化学反应前后溶液的酸碱性变化的。本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.48.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色，（二）实验流程基本原理实验2
6、分离以尿素为氮源的微生物实验2 分离以尿素为氮源的微生物以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。（二）实验流程基本原理涂布分离时，需要先将菌液稀释，一般稀释到10-510-7之间，然后取0.1mL的不同稀释度的菌液，放在培养皿的固体培养基上，再用消毒后的玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平面，在适当的稀释度下，可培养产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩大培养后，再做功能
7、性实验。（二）实验流程关键技术“涂布分离法”实验2 分离以尿素为氮源的微生物（1）制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养LB固体培养基和尿素固体培养基，放在超净工作台上，冷却至60 左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至2个培养皿中（做两组，共4个空白平板），轻轻摇匀，平放至凝固。实验2 分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程基本操作步骤（2）制备细菌悬液：在无菌条件下，在将1g土样加到装有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成102土壤稀释液，并依次制备出103107稀释液。例如，若想制备10-6的稀释液，可取0.5 mL 10-5的稀释液。取样时，尽量只取悬液，倒
8、入有4.5 mL无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。实验2 分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程基本操作步骤（3）涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取0.1 mL的稀释度为10-4和10-5的土壤稀释液（细菌悬液），分别加到装有全营养LB培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。实验2 分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程基本操作步骤（4）将培养皿倒置摆放在37恒温箱中培养2448h，观察菌落数。实验2 分离以尿素为氮源的微生物（二）
9、实验流程基本操作步骤实验2 分离以尿素为氮源的微生物观察实验结果与稀释度为10-5相比，LB培养基中的菌落数在10-4处理中，尿素培养基中的菌落数在10-4处理中。在相同的稀释度的情况下，尿素培养基中的菌落数于LB培养基中的菌落数，其原因是：。实验2 分离以尿素为氮源的微生物（二）实验流程基本操作步骤实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物具体内容标准具体内容标准活动建议活动建议探讨微生物的利用探讨微生物的利用观察并分离土壤中能分解观察并分离土壤中能分解纤维素的微生物。纤维素的微生物。观察该微生物能否分解其观察该微生物能否分解其它物质，讨论这类微生物它物质，讨论这类微生物的应用价值。的应用价值。
10、一、课程标准对于本实验的要求（一）内容安排1.尝试微生物选择培养的操作技术2.体现微生物的选择培养在筛选菌种中的应用实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物二、课程实验内容的安排及思考实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物（二）教材中实验内容安排1说出纤维素酶的作用，简述纤维素酶的应用价值。2说明培养基对微生物的选择作用。3分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶的菌株，观察、记录其对纤维素的分解作用。4体验能水解纤维素的微生物在环保中的意义。二、课程实验内容的安排及思考（一）需提前准备实验材料、仪器和试剂1灭菌锅或高压锅2直径9cm或12cm的培养皿、250mL三角瓶3自制保湿小室：有盖小玻璃缸（如
11、鱼缸），内加入少量水即可480g草炭土或枯树周边的土5牛皮纸（90cm2）2张、卷烟纸6张三、实验教学具体技术操作问题实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物（二）实验流程基本原理(1)纤维素酶及其作用植物细胞壁中的主要化学成有纤维素、半纤维素、果胶、木质素、蛋白质、水和外壳物质，其中纤维素是地球上最丰富的有机物质。在枯树或草炭土中有许多利用和分解这些物质作为能源的微生物，它们可分泌纤维素，酶促分解纤维素，常用的产生纤维素酶的微生物有绿色木霉、变异青霉、黑曲霉和根霉等。纤维素酶是一类酶的总称，可催化水解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖。纤维素酶包括酶C1酶、Cx酶
12、和葡萄糖苷酶(2)选择培养基对微生物的选择作用选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们不需要的微生物的生长，促进人们需要的微生物的生长。本实验的目的是分离并选择培养土壤中能分泌纤维素酶的菌株，纤维素是这类微生物可利用的碳源和能源。因为卷烟纸一般只含纤维素而不含其他物质，因此，只有能分泌纤维素酶并以纤维素为碳源和能源的微生物才能生长在卷烟纸上。实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物（二）实验流程基本原理(3)用“滤纸崩溃法”测定纤维素酶的活性一定大小的滤纸在纤维素酶的作用下，滤纸逐渐被破坏，以滤纸的破坏速度表示酶活性的大小，即滤纸破坏速度越快，纤维素酶活性越大。实验3 观察土壤中能分解
13、纤维素的微生物（二）实验流程基本原理实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物（二）实验流程实验基本操作步骤1、取两个250mL三角瓶编为1、2号，1号倒入100mL自来水；2号放入一半土壤（40g）；再将2个空培养皿编为1、2号，然后用牛皮纸包好。将上述物品放入灭菌锅，在1000g/cm2 压力下，121灭菌30min，如在高压锅中灭菌则需1h。赵金秋（西城教研）摄(2)取灭菌后的培养皿，1号放入灭菌土壤，2号放入未灭菌土壤。如土壤湿度不够，需加入一些1号三角瓶中灭菌后的自来水。(3)1、2号培养皿的土壤表面上均放在3张纸，尽量使土壤与纸接触。培养皿不加盖，但用纸盖上保湿。最后将两个培养皿放在较
14、高湿度的环境中，如自制的保湿小室。实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物（二）实验流程实验基本操作步骤观察实验结果46周后观察两个培养皿的变化，其中1号培养皿中的卷烟纸基本无变化，2号培养皿中的卷烟纸完全消失。总结实验结论在土壤中存在可分泌纤维素酶的微生物。实验3 观察土壤中能分解纤维素的微生物（二）实验流程实验基本操作步骤（师大生物实验室提供）本单元评价方式建议小结微生物提纯培养的方法，指导学生完成实验报告。实验报告应该包含实验题目、实验目的、实验材料用具、实验步骤、实验结果、分析讨论等。实验结果可以附以照片加以说明。为加强纪律管理，还可加入学生对整个实验过程的自评和互评。本单元评价方式建议自评互评师评ABCABCABC工作态度：实验全过程能与他人配合，积极参与，动手动脑实验效果：能客观记录实验现象，实验效果理想讨论分析：能积极参与实验结果的交流讨
