1、实验1：大肠杆菌的培养和分离1、微生物病毒细菌放线菌真菌原生动物一、微生物的基础知识(1)定义(2)种类(3)用途 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体（种群）菌落是鉴定菌种的重要依据 结构 异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长一 培养基的分类细菌扩增固体培养基：细菌的分离纯化一 培养基的分类半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)动力检测，保种一 培养基的分类成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无
2、机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，碱基等二、无菌技术1.无菌操作的目的防止培养基被其他微生物污染(及避免操作者被微生物感染)消毒：较为温和的方法，如酒精注：消毒不能杀死芽孢 灭菌：强烈，所有，完全无菌 灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min（牛奶）3、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒（空气）(1)常用消毒的方法：(2)常用灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121
3、下维持15-30min.2、无菌技术包括(1)将实验器具和培养基：高压蒸汽灭菌(2)接种环(针)、试管口:灼烧 灭菌(3)实验操作空间：酒精+紫外线 消毒（接种室(箱)、超净工作台）(4)双手:酒精 消毒(5)实验操作应在 酒精灯火焰 旁进行(6)避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品相接触。(7)棉塞(封口膜):只让空气通过，而空气中的微生物不能通过。灼烧灭菌高压蒸汽灭菌锅（2）在细菌培养的灭菌环节中，对待不同的设备装置用不同的灭菌方法。请在各对象后面选上灭菌方法。A.酒精擦拭B.火焰灼烧C.高压蒸汽灭菌D.G6玻璃砂漏斗过滤课堂巩固手。接种环。含NaHCO3的培养基。制备无菌水。ABDC 称
4、量-计算-溶化-灭菌-倒平板 灭菌：加上封口膜，用牛皮纸包好放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，1Kg压力灭菌15Min 倒平板 紫外灯，过滤风，酒精灯，酒精棉球 在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜 使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰 左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖 待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝
5、后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。从大肠杆菌斜面锥形瓶中的液体培养基 接种好后在37度摇床振荡培养12h 工具：接种环在接种前要灭菌 分离方法：平板划线分离法 原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次
6、划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。只能蘸一次、再次划线从上次末端开始、划好倒置培养1-2天、划线末端出现不连续的单个菌落灼烧接种环冷却划线（第一区域）蘸取菌液灼烧接种环冷却划线（第二区域）灼烧接种环冷却划线（第三区域）灼烧接种环冷却划线（第四区域）灼烧接种环冷却划线（第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养第一区域第二区域第三区域第四区域第五区域1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。将单菌落用划线法接种到斜面，37度培养24h后放入4度冰箱保藏
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