1、第一节基因工程概述一、基因工程的概念理解供体：提供_操作环境：_操作水平：_水平原理：_受体：表达目的基因本质：性状在_受体体内表达优点：克服_障碍，定向改造生物_远源杂交不亲和目的基因体外DNA分子基因重组受体性状二、基因工程的工具酶与载体1.限制性核酸内切酶和DNA连接酶作用结果限制性核酸内切酶_和_DNA分子内一小段特定核苷酸序列把DNA分子切割成不同的片段，产生_和平口末端DNA连接酶将具有_的2个DNA片段连接在一起形成_识别切割黏性末端黏性末端重组DNA分子2.载体运载工具(1)功能：将_导入受体细胞，并使其在受体细胞中_。(2)种类：_、_以及一些动植物病毒。(3)质粒：本质是细
2、菌细胞中小型_分子。【点拨】提取目的基因和切割载体使用同一种限制性核酸内切酶，目的是能形成相同的黏性末端，形成重组DNA分子。外源基因稳定遗传和表达质粒噬菌体环状DNA三、基因工程的一般过程1.获取_2.制备_3.转化_4.筛选出获得_的受体细胞5.培养受体细胞并实现_【点拨】在基因工程的操作中，只有转化受体细胞和筛选出获得目的基因的受体细胞步骤不出现碱基互补配对现象，其余都涉及碱基互补配对现象。目的基因重组DNA分子受体细胞目的基因目的基因功能表达基因工程的工具1.与DNA相关的酶(1)五种DNA相关酶的比较：作用底物作用部位形成产物限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA解旋酶DNA
3、(水解)酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNADNA分子DNA分子碱基对间的氢键磷酸二酯键形成脱氧核苷酸单链游离的脱氧核苷酸(2)限制性核酸内切酶和DNA连接酶之间的关系图示：2.作为载体的条件条件适 应 性稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择【高考警示钟】关于限制性核酸内切酶使用的注意事项(1)切割质粒需使用限制性核酸内切酶1次，切割目的基因则需要使用相同的限制性核酸内切酶2次。因为质粒是环状DNA，而目的基因在DNA分子
4、链上。(2)质粒DNA分子上限制性核酸内切酶切割位点的选择必须保证至少有一个标记基因是完整的，如果标记基因全部被切开则不便于鉴定与选择。【典例训练1】(2011浙江高考)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子【解题指南】1.知识储备(1)重组质粒必须具备的条件。(2)目的基因导入成功的标志。2.解题关键(1)明确每个重组质粒至少含一个限制性核酸内
5、切酶识别位点。(2)由题干信息“成功表达腺苷酸脱氨酶”推出目的基因导入成功，并能表达腺苷酸脱氨酶分子。【解析】选C。ada为目的基因，大肠杆菌为受体细胞，将目的基因导入大肠杆菌时如果能成功表达说明每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒；要让目的基因与质粒形成重组质粒，两者必须用同种限制性核酸内切酶切割，所以每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点；质粒作为载体的条件之一是有多种限制性核酸内切酶的识别位点，但每种限制性核酸内切酶只有一个识别位点，只能插入一个目的基因(ada)；ada导入大肠杆菌成功的标志是表达腺苷酸脱氨酶，因此每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。基因工程的具体操作步
6、骤1.获取目的基因方法一：从基因文库中获取。方法二：化学合成(人工合成)目的基因。有两条合成途径：(1)利用目的基因转录的RNA，在逆转录酶的作用下，逆转录成单链DNA，然后合成双链DNA。(2)根据氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成DNA分子。2.重组DNA分子的形成载体(质粒)DNA分子(含目的基因)同一种限制性核酸内切酶切割获得黏性末端获得目的基因重组DNA分子(环状重组质粒)DNA连接酶几点说明：(1)限制性核酸内切酶主要切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，具有自身保护的特点。(2)限制性
7、核酸内切酶只识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，对RNA不起作用。(3)用DNA连接酶连接时，可形成3种不同的连接物：目的基因载体连接物、载体载体连接物、目的基因目的基因连接物，导入受体细胞后，可利用抗性基因的差异进行筛选。3.将重组DNA分子导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法受体细胞转化过程农杆菌介导转化法显微注射技术Ca2+处理法体细胞受精卵原核细胞重组DNA分子农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA中得以表达重组DNA分子提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞感受态细胞重组DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子4.筛选含有目的基因的
8、受体细胞和目的基因的表达一般通过标记基因筛选含有目的基因的受体细胞，还可以通过以下方法检测和筛选：(1)对转基因生物的染色体DNA上是否插入目的基因进行检测筛选，方法是采用 DNA分子杂交技术。(2)对目的基因是否转录形成mRNA进行检测筛选，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。(3)对目的基因是否表达出蛋白质进行检测筛选，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交或在个体水平检测是否产生相应性状。【典例训练2】(2011山东高考改编)人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。(1)图中的高
9、血压相关基因作为_，质粒作为_，二者需用_切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有_有关。(2)重组DNA导入的受体细胞是大鼠的_细胞，常用的方法是_。(3)子代大鼠如果_和_，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和_。【解题指南】1.考查实质本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。2.解题关键高血压相关基因与质粒形成重组DNA后导入到受精卵细胞中，是DNA重组技术。【解析】(1)根据题干中“利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠”推出
10、，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。(2)重组DNA分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重组DNA分子导入细胞中。(3)如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明目的基因已经表达。(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。答案：(1)目的基因载体同一种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的切割位点(2)受精卵
11、显微注射技术(3)检测到相应蛋白质已患高血压(4)胚胎移植1.在基因工程中用来修饰、改造基因的工具是()A.限制性核酸内切酶和DNA连接酶B.限制性核酸内切酶和DNA酶C.限制性核酸内切酶和载体D.DNA连接酶和载体【解析】选A。DNA酶的作用是使DNA水解为基本单位，基因工程中不用DNA酶；修饰、改造基因与载体无关。2.(2012南京模拟)利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是()A棉花细胞中检测到载体上的标记基因B山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的基因C大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA D酵母菌细胞内提取到人的干扰素【解析】选D。基因完
12、成表达是合成相应的蛋白质，酵母菌细胞内提取到人的干扰素说明人的干扰素基因在酵母菌细胞内完成了表达。3.切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，主要是从原核生物中分离纯化而来，下列有关限制性核酸内切酶的叙述错误的是()A限制性核酸内切酶种类很多，不同的限制性核酸内切酶识别不同的核苷酸序列B基因表达载体中的标记基因，含有限制性核酸内切酶切割位点C限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用恰好相反D在原核生物中，限制性核酸内切酶的作用是切割异源DNA，防止异源DNA入侵【解析】选B。基因表达载体中的标记基因有检测目的基因是否导入受体细胞的作用，若含有限制性核酸内切酶切割位点，被限制性核酸内切酶切割后不再具有标
13、记作用。4.(2012徐州模拟)利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素。下列相关叙述正确的是()A人和大肠杆菌在合成胰岛素时，转录和翻译的场所是相同的BDNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”C通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌D在培养大肠杆菌的工程菌过程中，获得目的基因的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA聚合酶【解析】选B。本题主要考查基因工程的基本工具以及基本操作步骤。人是真核生物，转录的场所主要在细胞核，大肠杆菌是原核生物，转录的场所在细胞质，所以A错误；DNA连接酶的作用是在基因工程第二步将目的基因与载体连接成重组DNA分子或形成基因
14、表达载体，它能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”，所以B正确；大肠杆菌中没有胰岛素产生，可能是重组质粒虽然导入受体菌，但目的基因未表达，所以C错误；获得目的基因的工具酶只有限制性核酸内切酶，所以D也错误。5.下列有关基因工程的叙述，不正确的是(多选)()A载体上的标记基因有利于促进目的基因在受体细胞中表达B用逆转录法合成胰岛素基因时可以从胰岛B细胞中提取相关的模板C目的基因导入受体细胞后，引起受体细胞的变异属于基因突变D限制性核酸内切酶和DNA聚合酶是基因工程中两类常用的工具酶【解析】选A、C、D。载体上的标记基因是为了便于检测目的基因是否导入受体细胞；目的基因导入受体细胞后，引
15、起受体细胞的变异属于基因重组；基因工程中两类常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶。6.(2011海南高考)回答有关基因工程的问题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶(限制性核酸内切酶)切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_(相同、不同)黏性末端的限制酶。(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与
16、mRNA杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_，常用抗原抗体杂交技术。(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_上。【解析】(1)限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平口末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。(2)基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；检测是否形成蛋白质，使用抗原抗体杂交技术。(3)此基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种，因此要把目的基因插入到染
17、色体的DNA分子中。答案：(1)平口相同(2)RNA聚合酶识别和结合的部位Ca2+分子杂交技术蛋白质(3)T-DNA 染色体DNA7.通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术可使羊奶中含有人体蛋白质，如图表示这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是-GGATCC-，请回答：(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是_，人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中需要的酶是_。(2)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。(3)人体蛋白质基因之所以能连接到羊的染色体DNA中，原因是_，人体蛋白质基因导入羊细胞时常用的工具是_。(4)此过
18、程中目的基因的检测与表达中的表达是指_。【解析】(1)切割目的基因需用限制性核酸内切酶，连接目的基因与载体需用DNA连接酶。(2)首先要按照碱基互补配对原则，由已知的一条链完成质粒双链上的碱基序列，再根据切点写出切割形成的黏性末端。(3)要求回答基因能够拼接的原因，不同生物的DNA化学组成和空间结构相同，即都具有相同的物质基础和结构基础。目的基因导入受体细胞需要先与载体结合，最常用的载体是质粒，也可以用动物病毒。(4)基因的表达是指基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状，即通过转录和翻译过程合成相应的蛋白质。答案：(1)限制性核酸内切酶DNA连接酶(2)(3)具有相同的物质基础和结构基础(有互补的碱基序列)细菌质粒或病毒(4)人体蛋白质基因在羊体细胞内控制合成人体蛋白质
