1、浙科版2019版总复习选择性必修三 第一节 体液调节是通过化学信号实现的调节 第一节 体液调节是通过化学信号实现的调节 第二节 神经系统通过下丘脑控制内分泌系统 第二节 神经系统通过下丘脑控制内分泌系统 第30课时 发酵工程 第十单元 生物技术工程 考点一 微生物的基本培养技术 1.培养基需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求，以及微生物生活所需要的能量来源。异养型生物：培养基中的有机物（有机碳源，无机碳源不提供能量）自养型生物：光能或者化学反应释放的能量。(1)某些异养型微生物在有有机物存在的情况下可同时将CO2转变为自身的物质，它们只是不以CO2为唯一(或主要的)碳源。(2
2、)自养型微生物也并非不能利用有机物生长。例如，紫色非硫细菌在没有有机物时可以将CO2转变为有机物，而当有机物存在时，它又可以利用有机物生长；它在有光照和无氧条件下可以利用光能生长，在黑暗和有氧条件下可以利用有机物生长。这种营养方式的可变性提高了微生物在环境中的生存能力。许多微生物的代谢方式并不唯一 蛋白胨、酵母提取物：为细菌生长提供碳源、氮源和维生素（生长因子）氯化钠：维持一定的渗透压 琼脂：凝固剂，不易分解，一般不作为营养物质。其在96 时融化成液体，冷却到45 以下即重新凝固。（LB培养基）LB固、液体培养基：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水、琼脂(固体培养基)豆芽汁、稻草浸汁、牛奶、血清
3、选择：菌种分离 鉴别：菌种鉴定 液体培养基：培养基液体状，没加凝固剂，常用于大规模快速繁殖某种微生物。固体培养基：培养基固体状，加了凝固剂（一般是琼脂）。包括“平板”和“斜面”。“平板”（菌落）可用于分离、鉴定、活菌计数“斜面”常用于菌种保存 菌种短期保存：在无菌条件下将单菌落用接种环取出，再用平板划线法接种在固体斜面上，在37 下培养24 h后，置于4 冰箱中保存。菌种长期保存：甘油冷藏法（-20）微生物在甘油中生长和代谢受到抑制达到保藏的目的。市售6上样缓冲液(loading buffer)；内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入加样孔内；含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝迁
4、移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源。1.将有（为液体状的固体培养基）培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上；2.打开超净台的紫外灯和过滤风（注意打开紫外灯后人必须离开）倒平板 3.待固体培养基冷却到60时（手放上还有 些热的时候），关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精 棉球擦手。4.在酒精灯火焰旁，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。将培养基分别倒至4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，待凝固后即形成平面。凝固后将培养皿倒置。（利于水分蒸发，防止冷凝水污染培养基）合成培养基：化学成分完全清楚的培养基，一般用于实验室进行
5、的、要求可重复性强的各项研究工作。天然培养基：成分还不十分清楚或成分不恒定的天然有机物制成的培养基。成本较低，除了在实验室常用外，更多被用于大规模的生物发酵工业。如：马铃薯蔗糖培养基、麦芽汁蔗糖培养基等。选择培养基和鉴别培养基的比较抑制不需要微生物的生长，促进需要的微生物的生长，从而提高对该菌的筛选效率 不能抑制不需要微生物的生长。酚红鉴定分解尿素的菌，不能筛选。选择培养基的常用设计方案 加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌。加入青霉素、卡那霉素等抗生素的培养基：分离导入了目的基因的受体细胞。加入高浓度食盐的培养基：分离耐盐的金黄色葡萄球菌。不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌。不加含碳有机
6、物的无碳培养基：分离自养型微生物。加入氨基蝶呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基：分离杂交瘤细胞。提醒：使用选择培养基对微生物进行筛选时，需设置对照实验，一般选择LB全营养培养基作为对照。实例：配制可用于培养酵母菌的马铃薯蔗糖培养基 培养基的配置过程 调pH值 混合加热融化（琼脂）确定配方 及用量 灭菌 分装 2.灭菌和无菌操作技术(1)目的：获得纯净的微生物培养物。(2)关键：防止杂菌污染。(3)消毒定义：采用较温和的物理、化学方法杀死物体表面或内部一部分不需要的微生物。原理：加热使蛋白质变性、紫外线使菌体的蛋白质和核酸变性。列举物理方法：煮沸消毒、紫外线照射等。列举化学方法：75%酒精、高锰
7、酸钾、5%次氯酸钠、漂白粉等。(4)灭菌：定义：采用强烈的物理、化学方法杀灭物体表面以及内部的一切微生物的方法，包括有些菌产生的芽孢结构。（在营养缺乏或代谢产物积累的环境中形成的没有繁殖功能的休眠构造，与细菌细胞结构不同，在休眠期间不进行明显的代谢活动，因而对加热、紫外线、化学药物都具有较强的抵抗能力。）高压蒸汽灭菌法、过滤除菌、灼烧灭菌的比较 对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。含葡萄糖的培养基也可采用适当降低温度、压力（500g/cm2、112）以及延长时间（30min）的高压灭菌。（防止其焦化）对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，
8、采用抽滤方式可较快地进行过滤灭菌。G6玻璃砂漏斗孔径最小，细菌不能滤过，使用前也要在121下用纸包好灭菌，使用后需用1mol/L的HCI浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至中性，干燥后保存。还有尿素、葡萄糖 培养皿、三角瓶、试管、移液器等常用高压蒸汽法灭菌，且灭菌后的 仪器要放在烘箱烘干，使用时取出放在超净工作台中，然后打开紫外灯和过滤风，灭菌30min.接种环常用灼烧灭菌，（接种环的环部、金属丝、金属丝与柄的连接部、连接部的上端）冷却后使用。玻璃刮刀（涂布器）使用前保存在75%的酒精中，使用时放在酒精灯火焰上（除去残留酒精），直到熄灭，冷却后使用。(5)防止杂菌污染的操作。操作工具的灭菌 操作在
9、酒精灯火焰旁进行，操作中超净台需一直打开过滤风(风吹向操作者)棉塞拔出后不能放在超净台消毒过后的台面上，打开塞子后和塞上塞子前都要将瓶口或者试管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌。打开培养皿的皿盖的正确操作是打开一条缝。接种前后接种环都需要灼烧灭菌。接种间、培养间定期采用紫外线或药物熏蒸灭菌或消毒，所有使用过的器皿、废弃物、培养基都必须先高压灭菌后再洗涤或倾倒。(5)防止杂菌污染的操作。3微生物的分离与纯化(1)接种：微生物进入培养基质的过程，包括自然接种和人为接种。(2)单菌落：固体培养基上通过接种、培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。接种方法（获得单菌落的方法）：
10、平板划线法和稀释涂布平板法(3)平板划线法与稀释涂布平板法的比较转移液体用微量移液器（管）4.活动 接种、培养并分离酵母菌(1)目的要求用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。用液体培养基大量扩增酵母菌。(2)方法步骤制作平板：对两个直径为90 mm的培养皿进行标记（底部或侧面），分别向其中倒入未凝固的固体培养基，使培养基铺满培养皿底部，厚度约2 mm。接种 用接种环蘸菌液_次，在固体培养基表面划线，下一次划线应从上一次划线的_开始。每次划线前接种环要 ，聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以在划线的末端出现不连续的 。若共划线五次，接种环要烧灼_次。另外：每次划线都不能与
11、之前的线条_；不能将最后一次划线与第一次划线相连；不能_培养基。培养基需 后，放入培养箱培养。划破 重叠 6 末端 1 例题1 灭菌 单菌落 倒置 注意：1.无论是何种划线法，蘸取菌种前和划线后，接种环都要灼烧灭菌。2.无论是何种划线法，菌种只蘸取一次。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？思考：操作的第一步灼烧接种环：是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环：是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的
12、数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后仍灼烧接种环：能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。菌种的活化：用无菌水冲洗掉菌苔接种到液体培养基短时培养。菌落：单个细菌细胞在固体培养基表面形成一个肉眼可见的具有一定形态的子细胞群体。菌苔：多个同种细胞群体连成一片。两者都只有一
13、种微生物。培养。将所有培养容器置于25下培养24 h。观察培养结果。获得单菌落后，可继续挑取菌落，利用划线法接种至斜面培养基中。5统计菌落数目的方法(1)稀释涂布平板法原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计数要求：在同一稀释度下涂布3个(或3个以上)平板。统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，因为当两个或多个细胞，连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。.过程：稀释菌液（10-5 10-7倍）涂布培养用移液器吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10
14、-1倍的稀释液，依次方法得到10-5 10-7倍稀释液。用移液器取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将涂布器放在酒精灯火焰上灼烧，待冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448h。分离、计数微生物稀释涂布平板法 无法计数 159 17 2 0 无法计数 141 13 1 0 无法计数 150 11 3 1 9ml 无菌水 加入0.1ml稀释液（移液器）例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？注意：1.分离得到单菌落一般以培养皿中有20个以内菌落为
15、宜。2.计算微生物数量一般以培养皿中有30300个菌落为宜。（159+141+150）310105=1.5108个/g 现取5mL陈泡菜汁用于测定其中的乳酸菌含量,可采取 方法进行操作:取0.5mL泡菜汁逐级稀释至10-5,取10-4、10-5稀释液各0.ImL,分别接种到固体培养基,置于特定环境培养48h后，菌落计数。若培养結果如下图所示，则5mL陈泡菜汁中乳酸菌约 个.稀释涂布平板法 7x107 例2。(2)显微镜直接计数法（血细胞计数板计数法）原理：利用特定血细胞计数板，在显微镜下计算一定体的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。（每个计数板的正中央有两个计数区）玻片中部有四条下凹的槽
16、，将玻片中部分割成三个平台，中央平台比两侧平台低0.1mm 显微镜下观察 a.大方格：9个。长、宽各1 mm。液体体积1 mm20.1 mm0.1 mm3。计数区正中间的大方格为红细胞计数区。四角的四个大方格是白细胞计数区。b中方格：红细胞计数区又用双线分成25(或16)个中方格。c小方格：每个中方格再用单线划分为16(或25)个小方格。计数时的几个注意点先将专用的盖玻片盖在计数板上，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加摇匀（计数准确）的酵母菌悬液，让菌液渗入盖玻片下直至充满计数区。滴加菌液要避免菌液滴到盖玻片上并防止产生气泡，以免影响计数结果；对有25个中方格的红细胞计数区可采用“五点取样”对酵
17、母细胞进行计数；在计数每一小方格中的细胞数时，为了避免重复计数压在小方格边缘线上细胞的数目，应“数上不数下”“数左不数右”；为了保证结果的可信度，消除误差，应对同一红细胞计数区中的细胞数进行3次计数后取平均值，再按比例（1个大格液体体积为0.1 mm3，1ml=1000 mm3）进行换算。小思考：显微镜直接计数法有什么缺点吗？【答案】不能区分死菌和活菌；个体小的菌体在显微镜下难以进行观察。例3：回答下列相关问题。（1）用血细胞计数板对酵母菌计数时，吸取培养液前要轻轻振荡几次试管的目的是_。（2）若计数室为1mm1mm0.1mm方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多,难以计数,应
18、先_后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有_个。计数微生物显微镜计数法 使酵母菌分布均匀，计数准确 稀释 2108 影响实验结果的误差分析及改进办法 例题4.红细胞计数区由2516=400个小方格组成,容纳液体的总体积为0.1 mm3。现将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释,用无菌吸管吸取少许摇匀的酵母菌悬液滴在盖玻片边缘,使其自行渗入计数区,并用滤纸吸去多余菌液。现观察到图中所示a、b、c、d、e5个中方格内共有酵母菌44个,则上述 1 mL酵母菌样品中约有菌体()A.2.2108个 B.2.2107个 C.2.2106个 D.2
19、.2104个 A 思考：测定谷氨酸棒状杆菌的数目可采用的计数方法有显微镜直接计数法和_，前者计数的结果比后者计 数的结果值偏_(填“大”或“小”)，原因是 稀释涂布平板法 前者死、活菌体一起计数，后者只计数活菌数，且可能有多个菌体形成同一个菌落。大 6能分解尿素的微生物的分离与计数(1)实验原理当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶（分泌蛋白）的微生物才能在该培养基中生长。（还包括固氮菌）微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂，就可根据菌落周围培养基是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。在相同培养条件下，圆形红色区域
20、愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。（NH2）2C=O+H2O 2NH3+CO2 脲酶(2)实验步骤 不按照稀释度由大到小的顺序依次操作会影响实验结果。如果先取用稀释度小的溶液，微生物浓度大，再用同一移液器吸取稀释度大的菌液，就会提高后者的细菌数目，从而导致较大的统计误差。既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。注意事项：(1)尿素固体培养基中琼脂糖替代琼脂的原因是：琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，可能为细菌生长提供氮源，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选；培养基注意点(2)尿素固体培养基既是选择培养基也是鉴别培养基的原因是：培养基中尿素作为唯
21、一氮源，则为选择培养基；培养基中含有酚红指示剂，则可鉴别筛选出的微生物能分解尿素；(3)培养基中各种物质并不都是通过高压蒸汽灭菌法进行灭菌的，如尿素遇高温会分解，所以需进行过滤除菌，然后加入经高压蒸汽灭菌的培养基中 操作注意点(1)取样的地点最好选择尿素含量丰富的区域，如哺乳动物经常排泄的区域；(2)土样必须用无菌水进行稀释，否则无法判断最后菌种来源于未灭菌的水还是土壤；(3)每次稀释前，试管需进行充分振荡处理，目的是使菌体分布均匀，取上清液1ml，转移至盛有99ml无菌水的试管中（土壤中一般为好氧菌）。结果分析注意点(1)设置LB固体培养基的目的是说明土壤中存在大量微生物，但能分解尿素的微生
22、物比例低；(2)尿素固体培养基中若形成菌落，无法说明活动成功，因为有些固氮菌能直接利用空气中的氮气进行繁殖，最后形成菌落，所以还需观察菌落周围是否出现红色区域；(3)若培养基中出现5个带有红色区域的菌落，不能说明都是同一种微生物，可能是5种微生物，但都能合成脲酶，分解尿素。考点二 发酵工程及其应用 1.传统发酵技术与发酵工程2.发酵食品的不同风味由多种因素造成(1)不同微生物或同种微生物在不同环境条件下进行的代谢活动所形成的代谢产物不同，制成的发酵食品的风味也就不同。(2)不同的微生物、不同的菌株能够分泌的酶种类不同，分解大分子有机物后形成的产物也就不同。(3)菌株遗传上的差异会造成发酵产品的
23、风味不同。(4)混菌发酵也影响发酵食品的风味。菌种微生物的种类、代谢特点、种间关系等都是造成不同发酵制品风味和营养物质有差异的原因。3活动：体验传统发酵利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋(1)制作原理与发酵条件当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，反应式：C6H12O6+2O22CH3COOH+2CO2+2H2O+能量 一是提供部分氧气促进酵母菌的需氧呼吸,进而促进酵母菌的大量繁殖,提供更多的菌种;二是保证发酵过程中不会有葡萄汁溢出。提高酒精的产量，更多底物，可加速反应，便于直观观察。（制醋需要足够的酒精）制作果酒时,哪些措施保证了无氧条件 用凡士林密封吸管与小洞的连接处;吸管的
24、长臂插入水中阻止氧气进入（2）制作步骤（1）制备装置：在矿泉水瓶盖上戳一个小洞，将可弯折吸管的短臂插入小洞，再用凡士林密封吸管与小洞的连接处。待装入葡萄、盖好盖子后，再将吸管长臂插入水中阻止氧气进入 （2）处理材料：将葡萄用清水洗净、晾干后，连皮挤碎后分别放入编号为1、2的两个矿泉水瓶中。所放入的葡萄体积不要超过矿泉水瓶的1/2。为提高酒精产量可在两个矿泉水瓶中适当添加白糖 制备装置处理材料 思考：1.将吸管的长臂端插入水中制作果醋时，为什么要给发酵好的果酒通入空气？2.打洞的位置应尽量避免开口向上，也不要把洞开得过大？发酵：(1)将少量干酵母用温水调匀后放入1号矿泉水瓶中，2号矿泉水瓶中，不
25、加干酵母，其他处理同1号。盖好盖子后，将吸管长臂插入水中以阻止氧气进入。(2)将两个矿泉水瓶放在25左右的环境中发酵。每天定时观察矿泉水瓶内葡萄的变化以及吸管长臂排出气泡的速度。710天后，待不再有气体产生时，停止发酵。用小刀在发酵液面以上将瓶壁戳一个小洞，将瓶中的上清液倒入相同编号的另一干净矿泉水瓶中，置于冰箱4冷藏室中静置保存，即得到自制的葡萄果酒.(3)选取酒味较重的一瓶，用小刀在矿泉水瓶壁（液面之上）戳一小洞，放置在温暖的环境中（30左右）。24h后打开瓶盖就会闻到果酒在有氧条件下发酵产生的果醋的气味.将空气通入果酒时，空气中的醋酸菌进入发酵液，在有氧条件下将乙醇氧化成醋酸，进而制作果
26、醋。这样既可以减少环境中其他微生物的进入，也可以减少所产生的醋味逸散。特别提醒 制作果酒、果醋的注意事项(1)果酒发酵过程中产生的部分CO2会溶于发酵液而使发酵液的pH下降。(2)由于果酒发酵旺盛期CO2产生量大,因此需及时排气,以防止发酵瓶爆裂。(3)在缺氧、呈酸性的发酵液中,酵母菌可以生长繁殖,而绝大多数其他微生物因无法适应这一环境而受到抑制。(4)乙醇与酸性条件下的重铬酸钾反应形成灰绿色,可对乙醇进行检测;闻味(出现酸味)可判断是否产生醋酸。(5)当氧气、糖源都充足时,醋酸菌将葡萄中的糖分解成醋酸;当缺少糖源时,醋酸菌将乙醇变为乙醛,再将乙醛变为醋酸。制果醋一般不直接利用葡萄糖氧化生成醋
27、酸.而是借助酒精发酵的产物进行。因为在酒精发酵过程中，蛋白质、脂质等其他有机物被分解为口味独特、营养丰富的小分子有机物，使食醋独具特色，且发酵过程不易遭受杂菌污染 原理：泡菜是利用附生在蔬菜表面的植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等发酵制成的。制作步骤(1)处理材料：将圆白菜、白萝卜等洗净，切成34 cm长的小块；将泡菜坛洗净，用开水清洗坛子内壁2次，确保没有油脂附着在内壁上（否则泡菜水会“生花”长出白色霉点）。(2)腌制泡菜用盐和冷开水配制成6%的盐水：取6 g食盐，溶于100mL冷开水中，按此比例配制成所需体积的盐水。4.活动:体验传统发酵利用乳酸菌发酵制作泡菜 冷开水是煮沸后冷却的水。煮沸有
28、两大作用,一是除去水中的氧气,二是杀灭水中的微生物。冷却是为了防止水温度过高杀死蔬菜表面的乳酸菌。将蔬菜、花椒、八角、白酒等放入坛内。白酒作用：抑制泡菜表面杂菌生长，调味剂增加醇香将盐水加入坛中，没过蔬菜，基本装满泡菜坛。盖上泡菜坛盖，用水封住坛口，防止外界空气进入。在腌制过程中须随时加满水。作用：造成无氧环境的方法，这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧腐生菌生长，蔬菜会腐烂变质。蔬菜在泡菜坛内腌制7天左右即可食用。取出腌制好的泡菜后，可以再加入新鲜蔬菜继续腌制。陈泡菜汁可以缩短腌制时间？（发酵菌）小思考：1.制作泡菜过程中，盐的作用是什么？在制作泡菜过
29、程中，盐的作用是调味和抑制微生物生长若盐含量过低，则易造成细菌污染。2.在泡菜腌制过程中,泡菜坛中冒出气体说明什么?蔬菜上存在酵母菌,气泡是酵母菌等微生物进行细胞呼吸产生CO2形成的。核心归纳：1泡菜制作的注意事项(1)材料的选择及用量蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。（亚硝酸盐含量低）用盐和冷开水配制成6%的盐水。(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。(3)氧气需求泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。将泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常向水槽中补水(4)控制
30、适宜的温度：控制在室温即可，温度偏高有害菌活动能力强，温度偏低不利于乳酸发酵。腌制过程中,要注意控制时间、温度和食盐用量,防止杂菌的大量繁殖和亚硝酸盐含量过高（亚硝酸盐含量的影响因素）(5)泡菜腌制及质量检测指标：成功的关键是营造无氧环境。检测指标有乳酸的含量、泡菜的色泽和风味，在初期发酵的末期和中期发酵阶段，泡菜的乳酸含量为0.4%0.8%，风味品质最好，因此，常把这个阶段作为泡菜的成熟期。也可以在显微镜下观察乳酸菌形态，比较不同时期泡菜坛中乳酸菌的含量。2.泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化 项目 乳酸菌 乳 酸 亚硝酸盐 初期 少(有氧气,乳酸菌活动受抑制)少 增加(硝酸盐还
31、原菌的作用)中期 最多(乳酸抑制其他菌活动)增多,pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制,部分亚硝酸盐被分解)后期 减少(乳酸继续积累,pH继续下降,抑制自身活动)继续增,pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)注意：亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而 不是硝化细菌氧化氨形成的。据图乙分析,泡菜在什么时间食用比较合适?为什么?乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的含量变化 11 d以后,此时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平。例题5.回答下列有关泡菜制作的问题。(1)制作泡菜时,所用水要煮沸,其目的是 。为了缩短制作时间,有人还会在盐水中加入少量陈泡菜液,加入陈泡菜液的目的是 。(2)泡菜
32、制作过程中,乳酸发酵过程即乳酸菌进行 的过程。该过程发生在乳酸菌的 中。(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有 、和 等。(4)从开始制作到泡菜质量最佳这段时间内,泡菜液逐渐变酸,这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是 ,原因是 。腌制时间 食盐用量 乳酸菌数量增多,杂菌数量减少 乳酸菌比杂菌更耐酸 杀灭水中的微生物并除去水中氧气 增加乳酸菌的数量 厌氧呼吸 细胞溶胶 温度（1）微生物工业发酵的基本过程 灭菌离心5.发酵工程及其应用（2）选育高产、优质的菌种是发酵工业的前提条件。发酵工业菌种需满足条件：(1)应选择高产的菌种，使菌种的发酵产物中，需要的产物多，不需要的产物少。(2
33、)培养基来源充足且廉价，被转化的效率高。(3)菌种发酵产物易于分离。(4)菌种对环境没有明显或潜在的危害。(5)菌种的遗传特性和生产能力稳定。（3）发酵过程中注意事项（1）菌种的选育：要得到符合要求的菌种，需要筛选并不断地选育或改良菌种，以保持菌种健壮旺盛的生命力。减少菌种的传代次数能减小菌种发生自发突变的概率。对于已出现衰退迹象的菌种要进行分离筛选，保留高产的菌株。（2）菌种的扩大培养：将菌种多次扩大培养，达到一定数量再接种，才能满足大规模生产的需要。可以缩短菌种在发酵罐中发酵的时间。（3）控制发酵过程：控制发酵过程是保证发酵生产高效顺利进行的重要措施。监控营养供给、PH、氧气、温度等变化。
34、（PH 改变：代谢产物的积累或酸碱物质消耗不均等。调节和控制培养液pH的方法:在培养基中添加缓冲液,在发酵过程中加酸或碱。）培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长 (1)过高的蔗糖浓度会抑制微生物的生长，过低的蔗糖浓度又不能满足微生物生长的需要。(2)在利用微生物发酵生产谷氨酸时，培养基中的C/N 为41时菌体大量繁殖，当比值降为31时，菌体繁殖减缓。(3)培养基中不同的N/P也会影响微生物的生长繁殖。冷却水：下进上出使培养基充分接触空气，充分冷却 叶轮：使气泡与发酵液混合，同时使微生物细胞与发酵液中的营养物质充分接触。高压空气分布器：将无菌空气分散成极小的气泡，使氧从气泡中进入发酵
35、液，增加溶氧。（4）环境不同，同种微生物的代谢产物可能不同。谷氨酸棒状杆菌在发酵过程中要不断地通入无菌空气，并通过搅拌使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中，当培养液中的碳氮比为41时，菌体大量繁殖而产生的谷氨酸少；当碳氮比为31时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸的合成量大增。在无氧条件下，谷氨酸棒状杆菌的代谢产物是乳酸或琥珀酸（5）菌种在不同的发酵阶段要求的环境条件是不同的。当菌种进入新鲜的培养基后，细胞吸收各种营养物质，代谢产生维持生命活动的氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等各种物质（初生代谢产物）。这些物质的积累与转化使微生物细胞具备细胞分裂的能力，使微生物群体进入一段快速生长和繁殖的阶段。在微生
36、物生长到一定的阶段后，会在细胞代谢的基础上进一步合成一些结构比较复杂的生物碱、抗生素、毒素等化合物（次生代谢产物）。这些物质对微生物自身的生命活动没有明确的功能，却正是人类需要的微生物发酵产物。对数期：选择和放料均加快，微生物进入高繁殖状态，主要是细胞数量的增加，产生初生代谢产物，构成细胞组织，所以代谢产物的产量下降。（4）分离或提纯发酵产品是工业发酵制取产品必经的步骤 如果发酵的产品是菌体本身，可采用过滤、离心、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来。如果发酵产品是微生物的代谢产物，则可采用真空发酵、吸附发、萃取发酵等方法提取。真空发酵是对发酵灌减压，使易挥发的发酵产物从发酵液中分离出来的技术，
37、吸附发酵在发酵过程中加入对发酵产物具有特异性或非特异性吸附作用的吸附剂，从而使发酵产物从发酵液中分离出来的技术。萃取发酵是回收和分离生物产物的一项技术。分离后的生物产品还需要进一步提纯，经过质检合格后才能成为产品。（2015年10月)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转人矮牵牛的核基因组中，培育新花色的矮牵牛。请回答:(1)为了获得大量的目的基因，将其与含有抗生素抗性基因的质粒DNA形成重组DNA,再与经(A.氯化钙B.氯化钠C.蔗糖D.葡萄糖)处理的大肠杆菌液混合，使重组DNA进人大肠杆菌。用的玻璃刮刀将稀释后的大肠杆菌液接种到含有抗生素的固体培养基上，经培养形成，再进行鉴定和扩大培养。
38、(2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA，用分别切割含目的基因的 DNA和农杆菌的Ti质粒，然后用DNA连接酶连接，形成重组DNA并导入农杆菌。A 灭菌 涂布 菌落 限制性核酸内切酶（2018年11月）回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与微生物培养及应用有关的问题：(l)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时 间应从 时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用 方式可较快地进行过滤灭菌。(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加 的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是 。(3)为筛选胞外-淀粉酶分泌型菌种，一般从 (A.果园树下 B.肉类加工厂周围C.米酒厂周围D.枯树周围）获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个 比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取 用于检测酶活性。达到设定的温度或压力值 抽滤 将淀粉分解成糖 作为碳源 C 水解圈直径与菌落直径 上清液