1、第2讲 微生物的培养与应用一、微生物的培养与应用 1.微生物的实验室培养(1)培养基概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。分类a按培养基的物质性质可以分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。b按培养基的化学成分可以分为天然培养基和合成培养基。c按培养基的用途可以分为选择培养基和鉴别培养基。培养基配方及营养要素基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。【友情提醒】微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳
2、源，又是氮源、能源。有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。制备：计算称量溶化灭菌倒平板。无菌技术主要操作要求a实验前应对操作空间、操作人员消毒，对所用器具和培养基灭菌。b实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。(2)无菌技术2纯化大肠杆菌以及菌种的保藏(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(2)纯化大肠杆菌原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。方法：平板划线法、稀释涂布平板法。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面
3、连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。(3)菌种的保藏短期保存：固体斜面培养基上4 保存，菌种易被污染或产生变异。长期保存：20 甘油管在冷冻箱中保藏。【友情提醒】平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的温度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。【例 1】分 析 下 面 培 养 基 的 配 方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：(1)在该培养基的配方中
4、，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_和_。(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？_。(3)培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌及消毒方法依次是()化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线灭菌 高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法 A B C D【解析】碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，可用干热灭菌；接种环可用灼烧灭
5、菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。【答案】(1)葡萄糖 尿素(2)有选择作用。因为此配方中尿素是惟一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长(3)A二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1分离的原理土壤中的细菌能合成脲酶，能把尿素分解成无机物。2分离分解尿素的细菌所使用的特定培养基分离分解尿素的细菌的培养基应为选择培养基，培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。其配方如下：KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO47H2O 0.2
6、g葡萄糖 10.0 g尿素(惟一氮源)1.0 g琼脂 15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL。3统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作 a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。计算公式：每克样品中的菌株数M
7、，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。4细菌分离与计数的实验流程土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数。【例2】可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是()A以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B以尿素为惟一氮源的培养基中加入二苯胺试剂 C以尿素为惟一氮源的培养基中加入苏丹试剂 D以尿素为惟一氮源的培养基中加入双缩脲试剂【解析】在以尿素为惟一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。此培养基既属于选
8、择培养基，又属于鉴别培养基。A三、分解纤维素的微生物的分离 1分解纤维素的微生物的分离 (1)实验原理即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(2)实验流程土壤取样：富含纤维素的环境。选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量。梯度稀释 涂布平板：将样品涂布于鉴别含CR的纤维素分解菌的培养基(固体)。挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈。【友情提醒】选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。涉及的微生物技术主要有：培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。【例3】下图为分离并统计分解纤维素的微生
9、物的实验流程，据此回答有关问题：(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_。(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基如下，整个实验过程严格执行无菌操作。如果将其中的纤维素粉换成_，菌落数_，即可说明选择培养基的作用。纤维素粉NaNO3Na2HPO4KH2PO45 g1 g1.2 g0.9 gMgSO47H2OKCl酵母膏0.5 g0.5 g适量【解析】(1)因为纤维素分解菌与耐热菌有不同的生活习性，生活在不同的环境中，故要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)因为葡萄糖是纤维素水解产生的、能被微生物直接利用的有机小分子，所以如果将
10、其中的纤维素粉换成葡萄糖，纤维素分解菌及其他细菌会生长繁殖得更快，故菌落数明显多于选择培养基。(3)因为稀释涂布平板法要将菌液进行一系列的梯度稀释，故该法可根据稀释体积计算每克样品中的细菌数，而平板划线法则不能这样，所以本实验宜采用稀释涂布平板法。【答案】(1)不同的菌株生活在不同的环境中，根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找 (2)葡萄糖 明显多于选择培养基上的菌落数(3)稀释涂布平板平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数1消毒和灭菌的区别用酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力
11、减弱。2.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。1.(2009安徽)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板
12、倒置，37 恒温培养2448小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数D【解析】本题考查的是选修1专题2“微生物的培养与应用”的有关知识。确定对照组无菌后，选择菌落数在30300的平板进行计数，求其平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数2.(2011新课标)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即和。原油选择平板划线法稀释涂布平板法
13、(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、和。无菌技术要求实验操作应在酒精灯附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。强干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰【解析】(1)题中想筛选分解原油的菌株，应该以原油为唯一的碳源。培养基分为选择培养基和鉴别培养基，本题是筛选菌株，属于选择培养基。(2)接种方法分为平板划线法和稀释涂布平板法。(3)菌株的分解能力越强，分解的原油越多，则分解圈越大。(4)微生物实验要求在无菌环境中操作，灭菌方法包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。3.(2011山东)研究发现
14、柚皮精油和乳酸菌素(小分子蛋白质)均有抑菌作用，两者的提取及应用如图所示。(1)柚皮易焦糊，宜采用法提取柚皮精油，该过程得到的糊状液体可通过除去其中的固体杂质。(2)筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或接种。对新配制的培养基灭菌时所用的设备是。实验前需对超净工作台进行处理。压榨过滤稀释涂布平板法(或稀释混合平板法)高压蒸汽灭菌锅消毒(3)培养基中的尿素可为乳酸菌A生长提供。电泳法纯化乳酸菌素时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越大，电泳速度。(4)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。可通过测定透明圈的来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。氮源越慢直径(或大小)4.(
15、双选)下列关于培养基的叙述，错误的是()A硝化细菌能以NH3作为氮源，但不能作为能源物质B各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养要素C特殊营养物质是某些微生物生长过程中需要额外补充的营养物质 D培养乳酸杆菌时培养基中不需要添加维生素AD【解析】硝化细菌能利用无机物氧化时放出的能量将CO2和H2O合成有机物。微生物的培养基除了含碳源、氮源、无机盐、水四种营养要素外，有的还要补充特殊营养物质，如培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素。5.某同学在做细菌培养实验过程中发现：某种细菌(记作S)的周围其他细菌的生长繁殖受到抑制。他认为，最可能的原因是S细菌产生了一种不利于其他细菌生存的物质。
16、为验证这一假设，实验组和对照组均使用相同的培养基，正确的接种方法应是()DA实验组接种S细菌，对照组接种其他细菌B实验组接种其他细菌，对照组接种S细菌C实验组接种其他细菌，对照组不接种，一段时间后，除去其他细菌，两组再分别接种相同的S细菌D实验组接种S细菌，对照组不接种，一段时间后，除去S细菌，两组再分别接种相同的其他细菌【解析】根据实验目的可知，实验的变量是S细菌所产生的物质，所以实验组先接种S细菌，一段时间后去除S细菌，其产生的物质残留在培养基中，而对照组不接种，然后再分别接种相同的其他细菌来检验抑制物质是否存在。6.请分析回答下列问题：(1)无菌技术主要通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。常
17、用的灭菌方法有灭菌、干热灭菌和灭菌。高压蒸汽灼烧(2)稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是()土壤取样称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，制备土壤提取液吸取0.1 mL溶液进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107的稀释度 AB CDC(3)利用酵母菌将葡萄汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现色。在发酵过程中，随着酒精度的提高，发酵液逐渐呈现深红色，原因是。灰绿红葡萄皮的色素进入发酵液(4)从野生酵母菌群中分离纯化酵母菌，最常使用的接种方法是和两种。酵母菌适合生活在偏酸性环境平板划线法
18、稀释涂布平板法而放线菌则适合生活在偏碱性环境中，分离二者所用的培养基称为。(5)在腐乳制作的过程中，起主要作用的微生物是，腐乳的制作是多种微生物的作用，微生物的作用是。选择培养基毛霉协同微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶将脂肪水解成甘油和脂肪酸(6)腐乳制作过程中影响其风味和品质的因素有哪些？()盐的用量 酒的种类和用量 发酵温度 发酵时间辛香料的用量 AB CDA7.某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌和酵母菌混合在一起。请你完成分离得到纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌的实验步骤，并回答有关问题：(1)主要步骤：制备两种培养基：一种是培养基，另一种是的培养基。分别分成两份，依次标上A、A和B、B，备用。分别向A、B培养基中接种。接种后，放在恒温箱中培养34天。无氮加青霉素混合菌分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌种，接种到A、B培养基中。接种后，把A、B培养基放入恒温箱中培养34天。(2)回答问题：在步骤中，为保证无杂菌污染，实验中应采用的主要措施有、。两个步骤的目的是。培养基高压蒸汽灭菌接种环在酒精灯火焰上灭菌接种过程在酒精灯火焰附近进行获得纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌
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