1、壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响李赫 刘宗英 张健 胡宗云摘要：在草鱼饲料中添加不同剂量的壳聚糖，连续投喂 42 d，研究壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响。结果显示，与对照组相比，壳聚糖可以提高血清溶菌酶活性、SOD 活性、AKP 活性、补体 C3 含量和血液白细胞吞噬活性，并能降低 MDA 含量。结果表明，饲料中添加 5 g/kg 的壳聚糖对草鱼的非特异性免疫功能有最好的促进作用。关键词：壳聚糖;草鱼（Ctenopharyngodon idellus）;非特异性免疫壳聚糖（chitosan，CS）又称壳多糖，是由天然聚合物甲壳素经过脱乙酰作用而得，通常将脱乙酰度大于 70%的称为壳聚糖，
2、其优点很多：良好的生物相容性、可自然降解性、粘膜吸附性、溶菌酶等可使其溶解、本身及其代谢物无任何毒副作用、调节生物体的免疫功能1-3。研究表明，壳聚糖对正常生理条件下和处于免疫功能低下的鱼体的非特异性免疫功能均具有提高的功能4-6，添加适量的壳聚糖可以提高俄罗斯鲟幼鱼的生长性能和免疫能力7。本试验通过在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）基础饲料中分别添加不同剂量的壳聚糖，研究其对草鱼免疫功能的影响，以期为预防草鱼疾病提供新方法。1材料与方法1.1试验鱼试验用草鱼来自辽阳市东荒农场，暂养后从中挑选规格整齐、体质健壮的鱼 350 尾（平均体质量 108 g），用 3%的食盐水
3、溶液消毒后，随机分成 5 组（每组 25 尾），每组 2个重复，放入 10 个（1.0 m1.0 m0.5 m）网箱中。设 2 个对照组。网箱放在 7.5m7.5 m1.5 m 的水泥池中。1.2试验设计在基础饲料（表 1）中分别添加壳聚糖 0 g/kg（C0 组）、2.5 g/kg（C1 组）、5g/kg（C2 组）、7.5 g/kg（C3 组）、10 g/kg（C4 组）。饲料原料经粉碎过 40 目筛后制粒，然后破碎成直径为 3 mm 的颗粒备用。饲料配制时，所添加的中药免疫增强剂以等量减少麦麸用量保持配方平衡。对照组投喂基础饲料。基础饲料组成及成分分析见表 1。1.3试验过程与饲养管理在
4、正式试验开始之前，将草鱼先暂养两周后转入网箱中。每天在早、中、晚三个时间投喂，投喂量为鱼体重的 4%。试验地点在辽宁省淡水水产科学研究院试验基地，试验周期为 42 d。试验期间，控制水温在 2328，DO 保持在 5 mg/L 以上，氨氮小于 0.3mg/L。1.4非特异性免疫指标的测定1.4.1样品的采集在第 42 天时进行取样，每箱取草鱼 3 尾，于尾静脉处采血，放入车载冰箱中保存，返回实验室后，于 4 下，2 500 r/min 离心 15 min，收集上层血清，立即测定。1.4.2血清指标测定溶菌酶活力按王雷等8的方法进行测定，溶菌酶活性（U）由下式计算：U=（A0-A）/A0，A0
5、为初始光密度值，A 为反应后光密度值。超氧化物歧化酶活性、碱性磷酸酶活性、丙二醛采用南京建成生物技术研究所生产的试剂盒进行测定。补体 C3 含量采用浙江伊利康生物技术有限公司所生产的试剂盒进行测定。白细胞吞噬活性的测定，于草鱼尾静脉处采血 500 L（采血管和注射器均提前用 1%肝素润洗），加入 200 L 嗜水气单胞菌悬液（浓度为 1108 cfu/mL），涡旋 30 s，37 水浴 30 min（同时每隔 5 min 轻轻振荡一次，共振荡 4 次），静置 10 min。从表面吸取上清进行推片，自然干燥后，经过固定、染色 1 min 后，用油镜进行观察。以吞噬百分比计算吞噬活性。吞噬百分比=
6、（100 个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100）100%。1.5数据分析与处理试验结果以平均值标准误表示，采用 SPSS17.0 统计软件对试验数据进行单因素方差分析和 LSD 多重比较进行统计分析，显著水平为 0.05。2结果2.1壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响由表 2 可知，溶菌酶活性随着壳聚糖添加量的增加而增大，其中壳聚糖添加量为 10g/kg 的溶菌酶活性显著高于对照组（P0.05）;壳聚糖添加量为 5 g/kg 的碱性磷酸酶活性最高，且与对照组差异显著（P0.05）;壳聚糖添加量为 5 g/kg 和 7.5 g/kg 的丙二醛含量显著低于对照组（P0.05）;补体 C3 含量随着
7、壳聚糖添加量的增加而先增加后降低，试验组均高于对照组，其中壳聚糖添加量为 5 g/kg 时补体 C3 含量最高。2.2壳聚糖对草鱼血液白细胞吞噬活性的影响由图 1 可知，白细胞吞噬活性随着壳聚糖添加量的增加而先增加后降低，添加量为 5g/kg 时达到最高，且试验组均显著高于对照组（P005）。3讨论溶菌酶在鱼类的非特异性免疫系统中占有重要的地位，也是评价非特异性免疫的重要指标，它对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的杀灭作用，其作用机制是将细胞壁中乙酰基多糖水解并释放出来，从而将侵入体内的异物进行破坏和消除，起到机体防御的作用9-10。常青11等發现，壳聚糖能够提高花鲈机体的补体活性、增强溶菌
8、酶活性和吞噬活性，并且还有一定的促生长作用。在本实验中，壳聚糖添加量为 10 g/kg 的溶菌酶活性显著高于对照组（P0.05）。超氧化物歧化酶能够清除机体内多余的自由基，使自由基的生成与清除处于一种动态平衡中，它还与生物的免疫功能有着密切的关系12-14。本实验中，试验组的超氧化物歧化酶活性均略低于对照组，但差异不显著（P0.05）。这与王秀华15的研究结果一致。AKP 通过改变致病菌的表面结构，来提高机体识别和吞噬致病菌的能力，进而达到提高鱼体免疫力的作用9-10。在本实验中，壳聚糖添加量为 5 g/kg 的组碱性磷酸酶活性最高，且与对照组差异显著（P0.05）。MDA 的含量可以反映出机
9、体遭受自由基攻击的程度。在本实验中，壳聚糖添加量为 5 g/kg 和 7.5 g/kg 时均可显著降低 MDA 含量，过低和过高添加量对 MDA 含量没有显著影响。补体在非特异性体液免疫系统中有着特别重要的作用，而 C3 在补体中又有着重要作用，激活它可以起到杀菌、溶菌作用。在本实验中，当壳聚糖添加量为 5 g/kg 时，草鱼血清中补体 C3 的含量达到最高，但继续增加壳聚糖，对补体 C3 含量反倒起到负作用，这与肖艳翼7和汪开毓16的研究结果相似。这说明，适量的壳聚糖可以激活草鱼体内补体 C3 的活性，增强草鱼的非特异性免疫功能，而过量的壳聚糖反而抑制了补体 C3 的表达。白細胞的吞噬功能是
10、动物非特异性免疫的重要组成部分10，它有吞噬作用、胞饮作用和趋化作用，免疫增强剂可以增强水产动物的这些防御反应。温小波17等的研究结果表明，黄鳝白细胞的吞噬活性在 0.51.5 g/100 g 时最高，但当壳聚糖的添加量达到 2.0g/100 g 时，白细胞的吞噬活性明显下降。曹志华18等的研究结果表明，添加 520g/kg 壳聚糖能提高白细胞的吞噬活性和溶菌酶活性。陈勇19等和翟少伟20等认为壳聚糖的添加量为 5 g/kg 时效果最好。在本实验中，壳聚糖对草鱼的白细胞吞噬活性有显著的提高作用，添加量为 5 g/kg 时，白细胞吞噬活性最高，这与陈勇等人的研究结果一致。综上，在本试验条件下，壳
11、聚糖能显著提高草鱼机体的免疫能力，建议饲料中适宜添加量为 5 g/kg。参考文献：1张耀武，郭黛健，陈万光.壳聚糖对异育银鲫生长及非特异性免疫功能的影响J.水利渔业，2008，28（4）：50-51，74.2 Hidangmayum A，Dwivedi P，Katiyar D，et al.Application of chitosan onplant responses with special reference to abiotic stressJ.Physiol Mol BiolPlants，2019，25（2）：313.3 张沛，姚朝增，韩锰，等.壳聚糖的特性分析及其免疫调节功能研究进
12、展J.药物分析杂志，2019，39（10）：1781-1791.4 Anderson D P，Siwicki A K.Duration of protection against Aeromonassalmonicida in brook trout immunostimulated with glucan or chitosan byinjection or immersionJ.Progressive Fish Culturist，1994，56（4）：258-261.5 华雪铭，周洪琪，张冬青，等.多糖和益生菌对暗纹东方鲀免疫功能的调节J.水产学报，2006，30（2）：230-235.
13、6 陈勇.异育银鲫饲料免疫增强剂和研究D.上海：上海大学，2005：85-90.7 肖艳翼，夏永涛，刘腾飞，等.壳聚糖对俄罗斯鲟幼鱼生长性能及免疫功能的影响J.水生生物学报，2017，419（1）：114-120.8 王雷，李光友，毛远兴.中国对虾血淋巴细胞抗菌、溶菌活力与酚氧化酶活力的测定及其特殊性研究J.海洋与湖泊，1995，26（2）：794-800.9 胡斌，李小勤，冷向军，等.饲料 Vc 对草鱼生长、肌肉品质及非特异性免疫的影响J.中国水产科学，2008，15（5）：179-185.10 汪成竹，姚娟，吴凡，等.免疫多糖（酵母细胞壁）对中华鳌非特异性免疫功能的影响 J.华中农业大学学
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16、化酶的影响J.云南农业大学学报，2009，24（4）：566-569.Effect of chitosan on the non-specific immune response of grass carp，Ctenopharyngodon idellus（Cuvier et Valenciennes）LI He，LIU Zongying，ZHANG Jian，HU Zongyun（Freshwater Fisheries Science Institute of Liaoning Proivince，Liaoyang111000，China）Abstract：The effects of c
17、hitosan on the ability of the non-specifiresponse of the grass carp Ctenopharyngodon idellus were studied and lysozymeactivity in serum，SOD activity in serum，AKP activity in serum，thecontent of serum complement C3，the content of MDA and the phagocyticactivity of leukocytes were tested.It was found t
18、hat，compared to the controlgroup，the addition of chitosan could increase lysozyme activity in serum，SOD activity in serum，AKP activity in serum，the content of serumcomplement C3 and the phagocytic activity of leukocytes，decrease the contentofMDA.The results indicated that the ability of non-specific immune responseof grass carp was enhanced by chitosa，and the chitosan supplement in dietswas suggested to be 5 g/kg for grass carp.Key words：chitosan;Ctenopharyngodon idellus;non-specific immune（收稿日期：2020-05-07）