1、专题九 现代生物科技第一讲 基因工程与克隆技术核心要点突破一、DNA重组技术的基本工具限制酶DNA连接酶运载体作用切割目的基因和运载体连接DNA片段，形成重组DNA携带目的基因进入受体细胞作用部位两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键作用特点(条件)(1)识别特定的核苷酸序列(2)在特定位点上切割(1)Ecoli DNA连接酶只连接黏性末端(2)T4DNA连接酶连接黏性末端和平末端(1)能在宿主细胞内稳定存在并大量复制(2)有多个限制酶切割位点(3)具有特殊的标记基因常用类型EcoRI限制酶Sma I限制酶EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶质粒、噬菌体、动植物病毒二、基因工程的基本操作
2、程序1基因工程的基本操作程序分析(1)目的基因的获取途径可以从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因组文库或cDNA文库中获取。人工合成目的基因(化学方法合成或逆转录)利用PCR技术扩增目的基因。通过PCR技术对已获取的目的基因进行扩增，可获取大量目的基因。(2)基因表达载体的构建基因表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因。基因表达载体的构建方法(3)将目的基因导入受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法(用Ca2处理)受体细胞受精卵体细胞(需经组织培养)受精卵原核细胞(4)目的基因的检测与鉴定导入检测：DNA分子杂交技术，
3、即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针检测。个体生物学水平鉴定：转基因生物是否具有抗性或转基因产品的功能活性。(根据目的基因表达出的性状判断)。2实验：DNA的粗提取与鉴定DNA的粗提取与鉴定三、基因工程的应用目的基因作用受体生物备注植物基因工程常用方法：农杆菌转化法；基因枪法；花粉管通道法抗虫转基因植物抗虫基因、Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因抗虫：Bt毒蛋白水解成多肽与肠上皮细胞结合，形成穿孔，细胞肿胀裂解致死；两种抑制剂分别抑制相应酶活性，影响消化；植物凝集素为糖蛋白，与肠黏膜结合，影响营养物质的吸收和利用棉花、水稻等抗虫但不抗病毒、细菌、
4、真菌等培育抗虫作物优点：减少环境污染、降低生产成本不同抗虫基因作用机理不同Bt毒蛋白基因来自苏云金芽孢杆菌抗病转基因植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、几丁质酶基因、抗毒素合成基因前两种为抗病毒作用；后两种为抗真菌作用烟草(抗病毒)、小麦(抗病毒)引起植物生病的微生物有病毒、细菌、真菌三大类抗逆转基因植物调节细胞渗透压基因；抗冻蛋白基因(从鱼体内获取)；抗除草剂基因通过改变细胞内渗透压，提高抗盐碱抗旱能力；耐寒能力提高；抗除草剂烟草(抗旱、抗盐碱)、番茄(抗寒)、大豆、玉米(抗除草剂)抗逆指抵抗不良环境的能力，如盐碱、干旱、低温、涝害等转基因改良植物的品质含必需氨基酸的蛋白质编码基因；控制番
5、茄果实成熟的基因；花青素代谢有关的基因控制合成的蛋白质含必需氨基酸多；延迟番茄成熟；改变花瓣的颜色玉米、番茄、牵牛花等赖氨酸、亮氨酸等都属于必需氨基酸动物细胞工程方法：显微注射法受体细胞：一般用受精卵提高动物生长速度生长激素基因促进生长，提高生长速度鲤鱼不能导入生长素基因转基因动物生产药物(生物反应器或乳房生物反应器)药用蛋白乳腺基因微生物蛋白基因启动子分泌乳汁来生产相应的药品奶牛部分人对乳糖会发生过敏反应转基因动物作器官移植的供体某种调节因子；设法除去抗原决定基因抑制抗原决定基因的表达；不能合成相应抗原猪选择猪的器官做人器官替代品的原因：其内脏构造、大小、血管分布与人相似；体内隐藏的致病基因
6、少微生物细胞工程方法：转化法受体细胞：大肠杆菌应用最广泛基因工程药品控制药品合成的相应基因，如人的胰岛素基因、干扰素基因、乙肝疫苗基因等生产合成相应的药品，如胰岛素、干扰素、乙肝疫苗等微生物，如大肠杆菌、酵母菌等选择微生物作受体的原因：繁殖快、单细胞、遗传物质少基因检测和基因治疗基因检测制作相应探针，利用DNA分子杂交原理，快速、准确检测人类某种疾病临床应用阶段基因治疗把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，可分为体外基因治疗和体内基因治疗两种方法仅处于实验阶段，仍有许多问题和困难制约该技术的开展，所以该技术并未在临床开展四、蛋白质工程及与基因工程的区别1蛋白质工程的流程项目蛋白质工程基因工程
7、区别过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列合成DNA表达出蛋白质获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果 生产自然界没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现2基因工程与蛋白质工程的比较五、植物组织培养与动物细胞培养的比较植物组织培养动物细胞培养原理细胞全能性细胞增殖培养基的物理性质固体液体(合成培养基)培养基的成分水、无机盐、
8、维生素、蔗糖、氨基酸、植物激素、琼脂等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果新的植株或组织新的细胞系或细胞株应用微型繁殖作物脱毒生产人工种子生产细胞产物转基因植物的培育蛋白质生物制品的生产皮肤移植材料的培育检测有毒物质生理、病理、药理学研究取材植物幼嫩的部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织条件均需无菌操作，需适宜的温度、pH、O2等条件细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合实质内容改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品(使后代具有双亲的特性)理论基础植物细胞全能性细胞增殖细胞融合原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合方法用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后，诱导原生质体融合用
9、胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散后，诱导细胞融合六、植物体细胞杂交与动物细胞融合比较结果获取“杂种植株”克服远缘杂交不亲和的障碍获得“杂种细胞”，以生产细胞产品用途克服远缘杂交不亲和的障碍，扩展杂交亲本范围，培育新品种制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等七、动物体细胞核移植八、单克隆抗体1制备过程2生产单克隆抗体的方法有三种(1)利用动物细胞融合技术形成的杂交瘤细胞生产单克隆抗体；(2)将目的基因导入浆细胞，利用基因工程生产单克隆抗体；(3)利用动物细胞核移植技术生产单克隆抗体。3特点：化学性质单一、特异性强、灵敏度高、可大量生产。4应用：(1)作为诊断试剂。(2)用于治疗疾病和运载药物，如生物导
10、弹。热点考向探究 转基因植物的生产过程(2010年高考浙江卷)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C将重组DNA分子导入烟草原生质体D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞【解析】构建重组DNA分子时，需用同种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，再用DNA连接酶连接形成重组DNA分子，而烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，所以A项错误。重组DNA分子形成后要导入受体细胞(若是植物细胞，则可导入其原生质体)，若导入的受体细胞是体细胞，经组织培养可获得转基因植物。目的基因为抗除草剂基因
11、，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，可用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞。【答案】A(2009年高考浙江卷)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是()A都需用CO2培养箱B都需用液体培养基C都要在无菌条件下进行D都可体现细胞的全能性【解析】动、植物成体的体细胞进行离体培养都要在无菌条件下进行，动物成体的体细胞离体培养用液体培养基，不能体现细胞的全能性，植物成体的体细胞离体培养不一定用液体培养基，能体现细胞的全能性。在动物细胞培养过程中需要CO2气体环境，以调节培养液的pH稳定，而植物细胞培养不需要CO2培养箱。【答案】C细胞工程的操作过程和条件基因工程的工具、步
12、骤及应用(2010年高考江苏卷)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_。(4)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。(7)为了从cDNA
13、文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。【解析】环状DNA分子中磷酸全部参与形成磷酸二酯键，被Sma限制酶切开后相当于一个正常的DNA分子，每个DNA分子单链各含有一个游离的磷酸基团；AT碱基对有两个氢键，而GC碱基对有三个氢键，GC碱基对含量越多，热稳定性越高；从图中读出：Sma限制酶破坏目的基因和标记基因；用BamH和Hind两种不同的限制酶处理，形成不同的黏性末端，能有效防止只用一种限制酶形成的相同的黏性末端的质粒或目的基因相互连接、环状化；将质粒与目的基因“缝合”应用DNA连接酶进行处理；标记
14、基因的作用在于鉴别和筛选含有目的基因的细胞；大肠杆菌突变体丧失吸收蔗糖的能力，不能在只有蔗糖为碳源的选择培养基上存活，所以可以用该种选择培养基对导入的蔗糖转运蛋白基因是否表达进行初步检测。【答案】(1)0、2(2)高(3)Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞(7)蔗糖为唯一含碳营养物质基因工程与细胞工程(2010年高考福建理综)红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床上使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技
15、术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)，其简要生产流程如右图。请回答：(1)图中所指的是_技术。(2)图中所指的物质是_，所指的物质是_。(3)培养重组CHO细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换_。(4)检测rhEPO的体外活性需用抗rhEPO的单克隆抗体。分泌该单克隆抗体的_细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。【解析】基因工程中获得大量目的基因的技术为PCR技术。cDNA是以mRNA为模板通过反转录获得的。本基因工程目的基因的表达产物为红细胞生成素，即EPO。由于天然EPO来源极为有限，一般情况下，基因工程产生的是重组人
16、红细胞生成素(rhEPO)。培养重组CHO细胞时，为了提供适宜的培养条件，需要不断更换培养液，以防止有害代谢产物的积累对细胞自身造成的危害。单克隆抗体是通过培养杂交瘤细胞获得的。【答案】(1)PCR(2)mRNArhEPO(3)培养液(4)杂交瘤高考真题体验1(2010年高考浙江卷)将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是()解析：由题意知，培养基中无植物激素，故无法进行正常的植物组织培养过程。而非洲菊可通过扦插方式用茎进行繁殖，故此过程可相当于植物扦插过程，最终可形成一完整植株。答案：B2(2010年高考江苏卷)下列关于转基因植物的
17、叙述正确的是()A转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中B转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加C动物的生长激素基因转入植物后不能表达D如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题解析：转入到油菜的抗除草剂基因可能会通过花粉被油菜的近缘物种接受，造成意料之外的抗除草剂基因传播，形成基因污染，有可能会对生态系统的平衡和稳定构成威胁，A项正确；在转入抗虫基因后，不能适应这种抗虫植物的昆虫的死亡率将大大增加，只有存在对应的抗性基因的昆虫才能生存下来，增加了昆虫群体中抗性基因的频率，B项错误；生物界中所有物种基因的转录和翻译用同一套密码子和相同的氨基酸，所以动物的生长激
18、素基因可以在植物体内得到表达，C项错误；即便转基因植物的外源基因来自于自然界，通过转基因工程后，可能会使目标生物出现非正常进化过程中的性状改变，有可能会影响生态系统的稳定性，D项错误。答案：A3为获得纯合高蔓抗病番茄植株，采用了下图所示的方法：图中两对相对性状独立遗传。据图分析，不正确的是()A过程的自交代数越多，纯合高蔓抗病植株的比例越高B过程可以取任一植株的适宜花药作培养材料C过程包括脱分化和再分化两个过程D图中筛选过程不改变抗病基因频率解析：过程为从F2中选择高蔓抗病植株连续自交，F2中的高蔓抗病植物中有纯合子和杂合子，杂合子自交发生性状分离，通过筛选再自交，自交代数越多，纯合子所占比例
19、高；F1代植株的基因型是相同的，都是双杂合子，所以在进行花药离体培养时可以用F1代任一植株的花药作培养材料，过程是植物组织培养的过程，包括脱分化和再分化两个过程；通过图中的筛选可以使抗病的基因频率增加。答案：D4(2009年高考浙江理综)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达解析：考查基因工程的工具、操作步骤及基因工程应用等知识，兼顾考查同学们的理解和综合运用能力。目前基因工程操作除实现
20、了原核细胞基因在原核细胞中表达，真核细胞基因在真核细胞中表达之外，也实现了原核细胞基因在真核细胞中表达以及真核细胞基因在原核细胞中表达，所以目的基因均可来自动、植物和微生物细胞，A项正确；限制酶和DNA连接酶是基因工程中常用的两类工具酶，所以B项正确；大肠杆菌由于无内质网、高尔基体等细胞器，不能实现对人胰岛素的加工包装等过程，所以其产物无活性，故C项正确；载体上的抗性基因不具有促进目的基因表达的作用，故D项错误。答案：D5(2010年高考天津卷)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma 直线所
21、示为三种限制酶的酶切位点。据图回答(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是_(填字母代号)。A启动子 BtetRC复制原点 DampR(3)过程可采用的操作方法是_(填字母代号)。A农杆菌转化 B大肠杆菌转化C显微注射 D细胞整合(4)过程采用的生物技术是_。(5)对早期胚胎进行切割，经过程可获得多个新个体。这利用了细胞的_性。(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填字母代号)技术。A核酸分子杂交 B基因序列分析C抗原抗体杂交 DPCR
22、解析：(1)基因表达载体的构建过程中，将目的基因导入受体细胞之前，要用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体。从图中可以看出，在目的基因和载体中都有Hind和BamH 限制酶的切割位点，因此要用Hind和BamH 限制酶同时切割载体和人乳铁蛋白基因；载体切割后四环素抗性基因被破坏，因此筛选时要在含氨苄青霉素的培养基上进行。(2)启动子是一段有特殊序列的DNA片段，位于目的基因的首段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，在启动子存在时才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。(3)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术。(4)过程
23、是将早期胚胎移入受体母牛体内，用到的技术是胚胎移植技术。(5)胚胎分割是利用机械方法将早期胚胎等分，经移植后获得同卵双胎或多胎的技术，可以看做动物无性繁殖或克隆的方法，利用了细胞的全能性。(6)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要用相应的抗体进行抗原抗体杂交，其他三项技术检测的对象都是核酸。答案：(1)Hind和BamH 氨苄青霉素(2)A(3)C(4)胚胎移植技术(5)全能(6)C6(2009年宁夏高考改编)回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面_时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_。此时，瓶壁上形成的细胞层数是_。要使贴壁的细胞从瓶壁
24、上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是_。(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现_的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成_细胞，该种细胞的黏着性_，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量_。(3)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到_期的细胞用显微镜进行观察。(4)在细胞培养过程中，通常在_条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中_的活性降低，细胞_的速率降低。(5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作_进行攻击。解析：(1)动物细胞培养过程中具有贴壁生长和接触抑制的特点，若要
25、传代培养应先用胰蛋白酶处理，使其从瓶壁上分离下来。(2)在传代培养过程中，随着传代次数的增多，绝大多数细胞停止分裂，进而出现衰老甚至死亡，极少数细胞遗传物质发生改变，克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这种细胞黏着性降低，细胞膜表面的糖蛋白减少。(3)若要观察染色体的数目，最好选择细胞分裂中期的细胞，因为分裂中期染色体螺旋程度最高，形态固定，数目清晰。(4)低温可以抑制酶的活性，从而降低细胞的新陈代谢速率。(5)皮肤移植后发生排斥反应，是因为机体把移植的皮肤组织当作抗原进行攻击。答案：(1)相互接触 接触抑制 单层(或一层)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡 不死性 降低 减少(3)中(4)冷冻(或超低温、液氮)酶 新陈代谢(5)抗原高效素能测评本小节结束请按ESC键返回
Copyright@ 2020-2024 m.ketangku.com网站版权所有