1、第二节 基因工程的原理和技术【教学目标】知识与能力方面：1简述基因工程的原理2描述基因工程基本步骤的几个步骤3举例说出筛选含有目的基因的受体细胞的原理过程与方法方面：运用基因工程的技术，提出解决某一实际问题的方案情感态度、价值观方面：关注基因工程的发展，体会S、T、S三者之间的关系。【教学重点】基因工程的基本操作步骤【教学难点】 从基因文库中获取目的基因筛选含有目的基因的受体细胞【教学方法】 讲授法。【教学课时】 1课时。【教学过程】导入新课）复习：基因工程的操作工具：限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体或载体）提出问题）先解决为什么要分五个步骤的问题，然后解决每一步骤的技术方法问题。1为什么要
2、有“目的基因的获取”这一步？学生活动）引导学生看本专题题图中基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”可以说这既是概念，也是原理。这里所说的“更符合人们需要”，就是目的，那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。2为什么要有“表达载体的构建”这一步？学生活动）思考：单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。课文中谈到构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表
3、达和发挥作用。3.为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？学生活动）思考讨论：教材指出含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。4.为什么要有“筛选含有目的基因的受体细胞学生活动）思考讨论：这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传只有通过检测、鉴定才能得知。5.为什么要有“目的基因的表达”这一步？学生活动）思考讨论：目的基因在受体细胞中的表达与否，决定了基因工程是否最终成功，必须进行鉴定，确定其是否表达。学习过程：一、目的基因的获取（问题引入）“目的基因的获取”有什么方法呢？你能推测出由mRNA
4、反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？（学生活动）学生思考讨论。（总结归纳）1970年，特明H.M. Temin）和巴尔的摩D. Baltimore）证实了RNA病毒中含有一种能将RNA转录成DNA的酶，这种酶被称为依赖RNA的DNA聚合酶，由于与中心法则中的从DNA到RNA的转录是反向的，所以称为反转录酶reverse transcriptase）。反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以53方向合成DNA的过程图1-3）。图1-3 由mRNA反转录形成cDNAcDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条
5、与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。1.PCR的扩增过程是怎样的？PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。第一步：将反应体系包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至9095 ，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：
6、将反应体系降温至5560 ，使两种引物分别与模板DNA链3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至7075 ，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。2.如何从基因文库中找到所需要的基因？从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。第一
7、步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。第五步，从该菌落中再提取目的基因。二、形成重组DNA分子（提出问题）1.作为基因工程表达
8、载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（学生活动）学生思考讨论。（总结归纳）不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：1） 生物之间进行基因交流，需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达；如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；2）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；4）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因或做成目的基因与
9、标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。1.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？主要考虑以下几方面的因素。1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达
10、，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。三、将目的基因导入受体细胞（提出问题）1、不同的受体细胞导入方法相同吗？2、导入是否意味着转化？（学生活动）学生思考讨论。（总结归纳） 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 导入植物细胞：农杆菌转化法（表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞）将目的基因导入受体细胞： 细菌 氯化钙 细胞壁的通透性增大 重组质粒进入受体细胞 目的基因随受体细胞的繁殖而复制导入动物细胞：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）导入微生物细胞：Ca2处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。提示：农杆菌转化法的原
11、理是利用农杆菌（胞内寄生菌）对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。四筛选含有目的基因的受体细胞（提出问题）1、筛选的目的是什么？2、筛选方法有哪些？（学生活动）学生思考讨论。（总结归纳） 筛选是为了确定重组DNA是否导入受体细胞。筛选的方法有两种。检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。五、目的基因的表达通过鉴定表达的蛋白产物或性状来确定目的基因是否表达。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗
12、体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。【板书设计】1.2 基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、形成重组DNA分子（基因工程的核心）三、将目的基因导入受体细胞四、筛选含有目的基因的受体细胞五、目的基因的表达【随堂练习】1基因工程常用的受体细胞有（ ）大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞AB CD2基因工程的操作步骤：使目的基因与运载体相结合，将目的基因导入受体细胞，检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，提取目的基因，正确的操作顺序是（ ）A B. C D【布置作业】完成学案和作业本上内容。【教学反思】因为基因工程对学生来说是比较抽象的，所以首先设置问题情景，利用生活中的的问题激发学生的学习兴趣，使学生在思索中学习新知识。在教学中要注意让抽象的语言在直观的插图中找到注释，在实际动手中形成正确的认识。还要引导学生从基因工程的整体思考问题，解决问题。w.w.w.GkStK.c.o.m