1、知识梳理要点突破知识梳理要点突破第14讲 微生物的利用知识梳理要点突破最新“加试”考纲1大肠杆菌的培养和分离。2.分离以尿素为氮源的微生物。知识梳理要点突破考点一 大肠杆菌的培养和分离1培养基(1)概念：培养基是根据细菌生长繁殖需要的各种营养物质人工配制而成的。基质知识梳理要点突破(2)比较选择培养基与鉴别培养基种类特点用途选择培养基根据 某一种或某一类微生物的特殊营养要求 或对一些物理、化学抗性而设计的培养基培养、分离特定的微生物鉴别培养基加入 某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化的培养基区别不同类型的微生物知识梳理要点突破(3)成分：包含水、无机盐、等，此外还要满足微生物生长对pH、
2、特殊营养物质以及氧气的要求。碳源氮源生长因子知识梳理要点突破2无菌技术实验操作过程中，应从以下几个方面注意避免外来杂菌的污染：(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁、消毒。(2)将用于微生物培养的、和等器具进行。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。器皿接种用具培养基灭菌酒精灯火焰附近知识梳理要点突破3微生物的纯化培养技术(1)原理在培养基上将细菌稀释或分散成个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。(2)两种纯化细菌的方法划线分离法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面的操作，将聚集的菌种
3、逐步稀释分散到培养基的表面。(如下图所示)单连续划线知识梳理要点突破涂布分离法：是将菌液进行一系列的，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。系列稀释操作(如下图所示)梯度稀释知识梳理要点突破4大肠杆菌的培养和分离(1)大肠杆菌特性：革兰氏性、兼性厌氧的肠道杆菌。用途：是技术中被广泛采用的工具。(2)培养实验中用培养基扩大培养大肠杆菌。阴基因工程LB液体知识梳理要点突破(3)分离培养基灭菌50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌 将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面 倒平板知识梳理要点突破在装有液体培养基的三角瓶
4、中接种大肠杆菌，培养12 h 划线分离用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿 培养观察培养皿倒置盖在下面，放在37 恒温培养箱中培养1224 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落接 种知识梳理要点突破(4)保存菌种用取出单个菌落，用法接种在斜面培养基上，37 培养24 h后，置于4 冰箱中保存。接种环划线分离知识梳理要点突破(1)平板倒置的原因：平板冷凝后皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(2)防止培养基外溅：在倒平板的过程中，不能
5、将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。知识梳理要点突破考点二 分离以尿素为氮源的微生物1菌种特点含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。2培养基以为唯一氮源的培养基培养，以培养基为对照。3实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成，致使pH升高，使酚红指示剂。尿素LB全营养NH3变红知识梳理要点突破4实验步骤制备培养基：将已灭菌LB固体培养基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，平放至凝固制备细菌悬液：用1 g土样配制不同浓度的细菌悬液知识梳理要点突破用分
6、离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整个平面上培养：倒置培养皿，在37 恒温箱中培养2448 h观察：培养基中菌落数量涂布分离法知识梳理要点突破深度思考1尿素分解菌中与分解尿素相关的特有物质是什么？其化学本质是什么？组成单元的名称是什么？提示 该物质为脲酶，脲酶的化学本质为蛋白质，组成单元为氨基酸。2本实验中使用的培养基缘何具选择作用？提示 本实验所使用的选择培养基以尿素为唯一氮源，凡不能分解尿素的微生物均因缺乏氮源而无法存活，故而起到“筛选”作用。知识梳理要点突破3本实验是否需设置对照？若需要应如何设置？提示 需设置对照组，常以LB全
7、营养培养基作对照，通过观察两种培养基上生长细菌的菌落数，即可确认所用的尿素培养基是否起到了筛选作用，即倘若起到筛选作用，则实验组培养基上生长的菌落种类与数量应明显少于对照组。知识梳理要点突破要点一 微生物的实验室培养与大肠杆菌的培养分离1实验室常用的消毒和灭菌的方法项目概念常用方法应用范围消毒使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法：在100 下煮沸56 min一般物品巴氏消毒法：在7075 下煮30 min或在80 下煮15 min一些不耐高温的液体，如牛奶化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等紫外线消毒法：紫外灯照射30 min接
8、种室、操作台知识梳理要点突破灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)燃烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌和试管口的灭菌干热灭菌：在160170 下灭菌12 h玻璃器皿、金属工具的灭菌高压蒸汽灭菌：在压力为100 kPa，温度为121 的条件下，灭菌1530 min培养基及容器的灭菌知识梳理要点突破2.微生物接种两种常用方法比较比较划线分离法涂布分离法工具接种环玻璃刮刀原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的
9、菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落知识梳理要点突破(1)划线分离法中每次灼烧接种环的目的第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。知识梳理要点突破(2)微生物培养后判断是否有杂菌污染的方法从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠、呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。用显微镜镜检观察菌的形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢
10、等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。上述方法较难区分同类的不同物种，需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢等。知识梳理要点突破对点小练1下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答下列问题。知识梳理要点突破(1)A过程配制的是通用细菌培养基，称为_培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持_。对培养基酸碱度的调节，应该在B过程的_(填“前面”或“后面”)。(2)D过程与C过程相比，培养基中增加的物质是_，E过程所需的温度是_。(3)D过程后，一个菌体便会形成一个_，这种
11、分离方法是_的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。(4)植物组织培养时，先配制MS培养基，再加入一定比例的植物激素，当生长素相对较多时，可促进_。知识梳理要点突破(5)植物组织培养和微生物培养都需要无菌操作，下列不适宜用高压蒸汽灭菌的是()A接种环和镊子B三角瓶和广口瓶C发芽培养基和生根培养基D用于培养的幼茎和幼芽知识梳理要点突破解析(1)LB液体培养基是通用的细菌培养基，LB固体平面培养基则用于划线分离形成单菌落。氯化钠的作用是维持培养基的渗透压。调节好酸碱度后才能进行灭菌，若灭菌后再进行调节酸碱度，又会产生新的污染。(2)在液体培养基的基础上加入一定量的琼脂可形成固体培养基。菌种应
12、置于4 C冰箱中保存。(3)通过划线分离后，一个菌体就会繁殖出一个菌落。(4)植物组织培养中生长素相对较多时，有利于生根，而细胞分裂素相对较多时，则利于生芽。(5)高压蒸汽灭菌常用于培养基、培养器材等的灭菌，而用于培养的幼茎和幼芽则不能进行任何灭菌操作，否则会导致细胞死亡。答案(1)LB液体 渗透压 前面(2)琼脂 4C(3)(单)菌落 消除污染杂菌(或纯化菌种)(4)生根(5)D知识梳理要点突破2(2014浙江自选，节选)(1)现有一份污水样品，某兴趣小组欲检测其中的细菌数，进行以下实验。将一定量的污水样品进行浓度梯度稀释。取适量不同稀释度的稀释液，用_法分别接种于固体平面培养基上，经培养后
13、进行计数。该实验应注意，接种前，从盛有_的容器中将玻璃刮刀取出，放在酒精灯火焰上灼烧，冷却后待用；分组时，需用_作为对照。(2)在上述细菌培养实验中进行计数时，应计数的是接种了()A各个稀释度样品的培养基上的细菌数B合理稀释度样品的培养基上的细菌数C各个稀释度样品的培养基上的菌落数D合理稀释度样品的培养基上的菌落数知识梳理要点突破解析(1)细菌的分离与计数常用涂布分离法，即用玻璃刮刀将一定体积的稀释液涂布到固体平面培养基上。玻璃刮刀在使用前需进行灭菌处理，即将其浸入体积分数为70%的酒精中，随后取出放在酒精灯火焰上灼烧，冷却后待用。为排除其他因素的影响，提高实验的可信度，实验中要设置空白对照。
14、(2)将菌液涂布到固体平面培养基上后，倒置放在恒温箱中培养，培养一段时间后，统计菌落数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，这样通过统计菌落数就可估算出待测样品的细菌数目，所以要选择合理稀释度样品的培养基上的菌落数。答案(1)涂布分离 70%酒精 未接种的培养基(2)D知识梳理要点突破要点二 微生物的筛选1微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用对照组作用现象结论未接种培养基有无杂菌污染的判断未接种的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染接种的LB全营养培养基选择培养基筛选作用的确认LB全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用知
15、识梳理要点突破2.选择培养基四种常见制备方法或实例知识梳理要点突破知识梳理要点突破(1)设置对照：可排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。(2)即使使用了选择培养基，所得到的微生物也未必全为“目标微生物”，因此，常需对选择培养基中菌落作进一步鉴定。知识梳理要点突破对点小练1请回答微生物培养和分离的有关问题：(1)欲从土壤中分离出能利用尿素的细菌：以_为唯一氮源且加入了_指示剂的培养基，用_法分离细菌。若培养基平板上有菌落存活且颜色变_，则说明分离成功。(2)分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了LB培养基，其成分_。知识梳理要点突破A前者含琼脂，后者不含琼脂和琼脂糖
16、B两者都含有琼脂C前者含有琼脂糖，后者不含琼脂糖但含琼脂D两者都不含琼脂和琼脂糖解析(1)分离能利用尿素的细菌，只需以尿素为唯一氮源，加酚红作指示剂，采用涂布分离法分离细菌，只要培养基中的指示剂变红，标志着存在脲酶水解尿素的反应，证明菌株可以以尿素为氮源。(2)分离以尿素为氮源的细菌所用培养基应含有琼脂糖，而分离大肠杆菌所用培养基则不含琼脂糖而含琼脂。答案(1)尿素 酚红 涂布分离(或涂布)红(2)C知识梳理要点突破2下图为分离以尿素为氮源的微生物的实验：知识梳理要点突破(1)实验目的是使用含有_的培养基分离能产生_酶的细菌；使用_作为指示剂，由颜色变化检测知酶所催化的反应，相关的反应式为_。
17、(2)制备尿素固体培养基过程中采用的灭菌方法有_、_。(3)从上图所示实验过程中可判断出细菌悬液C的稀释度为_，用_法分离细菌。知识梳理要点突破(4)下列关于此实验的叙述，错误的是()A土样应从有哺乳动物排泄物的地方取B取104、105的土壤稀释液各0.1 mL，分别涂布于全营养LB固体培养基、尿素固体培养基上C将实验组和对照组平板倒置，37 C恒温培养2448 hD在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌知识梳理要点突破解析(1)某些细菌中存在脲酶，可以将尿素分解产生氨，氨遇酚红显红色。尿素起到了选择作用。(2)可用高压蒸汽灭菌法和G6玻璃漏斗过滤法灭菌。(3)从图中可以分析出：A锥形瓶及B、C、D三支试管中的液体稀释度分别为102、103、104、105，对菌液的稀释是涂布分离法分离细菌时所必需的。(4)土样若从有哺乳动物排泄物的地方取，则尿素固体培养基上生长的菌落和LB全营养培养基上生长的菌落数没有明显的区分，不能形成鲜明的对照，应该随机取样。答案(1)尿素 脲 酚红(NH2)2COH2O 脲酶 2NH3CO2(2)高压蒸汽灭菌法 G6玻璃漏斗过滤法(3)104 涂布分离(4)A