1、微生物的培养与应用【知识梳理】 一、培养基的概念、种类及营养要素1概念：人们按照微生物对_营养物质_的不同需求，配制出供其_生长繁殖_的营养基质。2种类：按照培养基的_物理状态_划分为_液体培养基_和_固体培养基_。3营养要素：各种培养基一般都含有水、_碳源_、_氮源_、_无机盐_，此外还要满足微生物生长对_pH_、_特殊营养物质_以及_氧气_的要求。二、无菌技术1获得纯净培养物的关键是防止_杂菌_的入侵。2消毒和灭菌(1)消毒，常用方法有_煮沸_消毒法、_巴氏_消毒法和_化学药剂_消毒法。(2)灭菌，常用方法：_干热_灭菌、_灼烧_灭菌、_高压蒸汽_灭菌。三、纯化大肠杆菌的无菌操作本实验使用
2、_固体_培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分成_制备培养基_和_纯化大肠杆菌_两个阶段进行。四、筛选菌株1自然界中目的菌株筛选的依据：根据它对_生存环境_的要求，到相应的环境中去寻找。2实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_目的菌株_生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时_抑制_或_阻止_其他微生物生长。3筛选分解尿素的细菌：在选择培养基的配方中，把尿 素作为培养基中的唯一_氮源_，原则上只有能够利用_尿素_的微生物才能够生长。五、统计菌落数目的方法1常用方法：_间接计数(活菌计数)_法。2统计依据：当样品的_稀释度_足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个_活菌_。
3、通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。3操作：(1)设置重复组，增强实验的说服力与准确性。(2)为保证结果准确，一般选择菌落数在_30300_的平板进行计数。4计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的_平均菌落数_，V代表涂布平板时所用的_稀释液的体积_，M代表_稀释倍数_。六、设置对照1对照实验：是指除了_被测试条件_以外，其他条件都相同的实验。2主要目的：排除实验组中_非测试因素_对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如，为了确认培养基是否被杂菌污染，需以不进行接种的培养基培养作为空白对照。七、实验设计1土壤取样：(1)取样原因：土
4、壤有“微生物的_天然培养基_”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量_最大_，种类_最多_。(2)土壤要求：富含_有机质_，pH接近_中性_且潮湿。(3)取样部位：距地表约_38_cm_的土壤层。2样品稀释：(1)稀释原因：样品的_稀释程度_直接影响平板上生长的_菌落数目_。(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在_30300之间_，便于计数。3微生物的培养与观察：(1)培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养_温度_和培养时间。(2)观察：观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。菌落的特征：包括菌落的_形状_、_大小_、
5、隆起程度和_颜色_等。八、操作提示1无菌操作：(1)取土样的用具在使用前都需要_灭菌_。(2)实验操作均应在_火焰旁_进行。2做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的_种类_、_培养日期_以及平板上培养样品的_稀释度_等。3制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高_工作效率_。4菌种鉴定：细菌合成的_脲酶_将尿素分解成氨，使培养基的_碱性_增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_酚红_指示剂，培养某种细菌后，若指示剂变_红_，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。九、纤维素与纤维素酶1纤维素(1)化学组成：由_C、H、O_三种元素组成，是地球上含量最
6、丰富的_多糖_类物质。(2)分布及作用：_棉花_是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外木材、作物秸秆等也富含纤维素；纤维素是构成植物_细胞壁_的主要组成成分之一。(3)某些商品纤维素水溶性的_羧甲基纤维素钠_(CMCNa)不溶于水的_微晶纤维素_(Avicel)2纤维素酶(1)组成：纤维素酶是一种_复合酶_，包括三种组分，即_C1酶_、_Cx酶_、_葡萄糖苷酶_。(2)作用：C1酶和Cx酶使纤维素分解成_纤维二糖_，_葡萄糖苷酶_将纤维二糖分解为_葡萄糖_。十、纤维素分解菌的筛选1方法：_刚果红_染色法。2原理(1)含纤维素的培养基中加入的_刚果红_，可与纤维素形成_红色复合物_。(2)当纤
7、维素被_纤维素酶_分解后，形成的_纤维二糖_、_葡萄糖_不和刚果红发生这种反应，红色复合物就无法形成，培养基中出现以_纤维素分解菌_为中心的透明圈，可通过是否产生_透明圈_来筛选纤维素分解菌。十一、实验设计1流程2纤维素分解菌大多分布在_富含纤维素_的环境中。3通过选择培养基可增加纤维素分解菌的浓度。1下列有关培养基叙述正确的是()A培养基的营养成分都有碳源、氮源、水、无机盐B除水以外的无机物都属于无机盐C用培养基培养甲型H1N1流感病毒作为科学研究D培养基配制过程中应调pH，适应各微生物的生长【解析】固氮微生物培养基可无氮源，有的无机物如NH4NO3可作氮源，甲型H1N1流感病毒必须寄生在细
8、胞内，不能用培养基培养。【答案】D2某一种细菌要从环境中获取现成的亮氨酸(20种必需氨基酸中的一种)才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出下表中细菌菌株类型。根据实验者的目的，选用的培养基类型是()选项筛选不需要亮氨酸的菌株筛选抗链霉素菌株筛选不需要亮氨酸的抗链霉素菌株L SL SL SL SL SL SL SL SL SL SL SL S注：L：亮氨酸S：链霉素“”：加入“”：不加入如：L：不加亮氨酸S：加入链霉素A B C D【解析】不需要亮氨酸的菌株能够在不含亮氨酸的培养基上正常生长，而其他微生物则不能；抗链霉素的菌株能够在含链霉素的培养基上正常生长，而其他微生
9、物则不能；要筛选不需要亮氨酸的抗链霉素的菌株需要在不含亮氨酸但含有链霉素的培养基上培养。【答案】B3在接种操作的过程中，操作不正确的是()A要将接种环灼烧灭菌B取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位D接种后还要将管口灭菌加塞【解析】将灼烧过的接种环伸入菌种管内，在试管内壁或未长菌落的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌落，再从菌种管内抽出接种环。【答案】C4下列有关微生物培养与应用的说法正确的是()A天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基B接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理C大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的
10、配制和纯化大肠杆菌两个阶段D分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源【解析】天然培养基是成分不明确的培养基，并不是不需加工配制的培养基；实验者的双手需进行消毒处理；分离分解尿素的细菌时，尿素是唯一氮源而不是唯一碳源。【答案】C5以下有关生物技术实践的叙述中，不正确的是()A除活菌计数法外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法B在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合生物与环境相适应的生物学观点C在酿酒生产上，常向发酵罐中加少量尿素，其目的是作为氮源，用于酵母菌合成蛋白质和核酸D不能用稀释涂布平板法来测定土壤溶液中某活菌数目【解析】除活菌计数法外，显微镜直接计数也是测定微生物
11、数量的常用方法，A正确；在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合生物与环境相适应的生物学观点，B正确；在酿酒生产上，常向发酵罐中加少量尿素，其目的是作为氮源，用于酵母菌合成蛋白质和核酸，C正确；可用稀释涂布平板法来测定土壤溶液中某活菌数目，D错误。【答案】D6微生物培养是微生物工程中的基础技术，下列相关叙述正确的是()A病毒和细菌的培养基成分相同B平板划线法中的“线”是连续的、不分区域的C微生物培养基中并不是都必须添加碳源或氮源D在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒【解析】 病毒必须寄生在活细胞内才能进行生命活动，如可用活鸡胚培养病毒；平板划线法每次划线前都要灼
12、烧接种环，划线是分区域的；微生物种类不同，对营养物质的需求不同，应根据所培养微生物的需要确定培养基的成分；对培养基和培养皿要进行灭菌，而不是消毒。【答案】C7用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时()可以用相同的培养基都需要使用接种针进行接种都需要在火焰旁进行接种都可以用来计数活菌ABCD【解析】平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基；平板划线法使用接种针进行操作，而稀释涂布平板法使用涂布器进行操作；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基；平板划线法一般用于分离而不是计数。【答案】C8鉴别纤维素分解菌的培养基中碳源为()ACMCNaB木聚糖C纤维素D裂解
13、酶 【解析】分离纤维素分解菌的选择培养基中，加入纤维素粉，而鉴别纤维素分解菌的培养基中加入的是纤维素钠(CMCNa)。【答案】A9在做分离分解尿素的细菌实验时，一同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。该同学的结果产生的原因可能有()土样不同培养基被污染操作失误没有设置对照ABCD【解析】实验结果不同，最可能的原因是土样不同，其次是操作失误或培养基被污染，而与是否设置对照没有关系。【答案】A10在农业生产中发现一种广泛使用的除草剂(含氮有机化合物)在土壤中不易降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草
14、剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行_处理。(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从物理性质、用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是_。(3)在划线培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是_或有氧条件抑制了这些细菌的生长。(4)在固体培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是_，有透明带菌落利用的氮源主要是_，据此可筛选出目的菌。(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如下表所示：接种的菌种一般培养基实验处理及
15、结果A不生长添加营养物质甲，能生长B不生长添加营养物质乙，能生长AB能生长不添加营养物质甲、乙就能生长突变株A不能在一般培养基上生长的原因是_。突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是_。【解析】(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。(2)从物理性质来看，题图培养皿中培养基属于固体培养基；从用途方面来看，该培养基是以含氮除草剂为唯一氮源的选择培养基。(3)在以该除草剂为唯一氮源的培养基上，不能降解该除草剂的细菌(除具有固氮能力的细菌外)是不能生长的。(4)含一定量该除草剂的培养基不透明，菌落周围形成透明带是由于该除草剂被某些细菌降解导致的。(5
16、)突变株A的生长依赖于营养物质甲，突变株B的生长依赖于营养物质乙。不添加营养物质甲和乙，二者混合培养时都能生长，最可能的原因是突变株A为突变株B提供了营养物质乙，突变株B为突变株A提供了营养物质甲。【答案】(1)稀释(2)以该除草剂为唯一氮源的固体培养基(3)培养基中缺少这些细菌可利用的氮源(4)氮气该除草剂(5)突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供 11下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是()A可采用干热灭菌法对微生物培养基进行灭菌B测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法C分离土壤中不同的微生物，
17、要采用不同的稀释度D分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源【解析】培养基灭菌通常用的是高压蒸汽灭菌法，而干热灭菌法通常适用于玻璃器皿、金属用具等耐高温且不适合其他方法的物品；分离能分解尿素的细菌，用的选择培养基里尿素是唯一的氮源，这样才能分离出分解尿素的细菌。【答案】A12某学者欲研究被石油污染过的土壤中的细菌数并从中筛选出能分解石油的细菌。下列有关操作错误的是()A利用平板划线法对细菌进行计数B利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌C采用稀释涂布平板法分离菌种D称取土壤和稀释土壤溶液时应在火焰旁【解析】平板划线法能对细菌分离纯化但不能计数，通常将被石油污染过的土壤浸出
18、液稀释后，采用稀释涂布平板法分离分解石油的细菌菌种，并对菌种进行计数；筛选能分解石油的细菌只能利用以石油为唯一碳源的选择培养基；称取土壤和稀释土壤溶液过程中的每一步都要在火焰旁操作。【答案】A13细菌荚膜的观察是微生物形态结构观察的基本内容之一。硅酸盐细菌在无氮培养基、钾细菌培养基及硅酸盐细菌培养基上均能生长，形成较厚的荚膜。下表1为无氮培养基的配方，表2是每种培养基上每个稀释度的菌落数及菌落直径情况。请回答下列问题：表1无氮培养基的配方葡萄糖10.0 gK2SO40.2 gK2HPO40.2 gCaCO35.0 gMgSO47H2O0.2 g琼脂20.0 gNaCl0.2 g将上述物质溶解后
19、，用蒸馏水定容至1 000 mL表2各稀释度平板上菌落数及菌落直径培养基种类各稀释度对应的平均菌落数菌落直径(mm)103104105106无氮培养基323201.02.0钾细菌培养基36640.6多数小于1.5硅酸盐细菌培养基50851.2多数大于2.0(1)根据无氮培养基的配方可知，从物理性质上看该培养基属于_培养基；从功能上看，该培养基属于_培养基，理由是_。(2)硅酸盐细菌能在无氮培养基中生长，推测该细菌具有_功能。(3)为统计硅酸盐细菌的数目，应采用_法进行接种，该方法的所有操作都应在_附近进行。(4)进行上述实验的同时也设置了空白对照，空白对照的培养基中_，说明培养基灭菌合格。根据
20、表2中的数据可以得出，用_培养基筛选硅酸盐细菌的效果最好。【解析】(1)培养基中添加了一定的琼脂，且该培养基是用来观察菌落与测定菌落直径的，因此该培养基为固体培养基。无氮培养基里不含氮源，故从功能上看，该培养基属于选择培养基。(2)硅酸盐细菌能在无氮培养基中生长，推测该细菌具有固氮功能。(3)从“稀释度”以及“菌落数”等信息可以分析出，硅酸盐细菌的接种方法应是稀释涂布平板法，所有操作都应在酒精灯火焰附近进行。(4)为检测培养基灭菌是否合格，需设置空白对照：空白对照的培养基中无菌落长出，说明培养基灭菌合格。从“平均菌落数”以及“菌落直径”可以看出，硅酸盐细菌培养基筛选硅酸盐细菌的效果最好。【答案】(1)固体选择配制的培养基中无氮源(2)固定空气中氮气的(或固氮)(3)稀释涂布平板酒精灯火焰(4)无菌落长出硅酸盐细菌