1、1微生物的营养：碳源、氮源、水、无机盐和生长因子。2微生物培养的无菌技术 进行无菌操作主要是为了防止外来杂菌的入侵，重点 是消毒和灭菌。(1)消毒和灭菌的区别 使用方法结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法等灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌(2)三种常用灭菌方法的比较 灭菌方法适用材料或用具灭菌条件灭菌时间灼烧灭菌接种环、接种针或其他金属工具酒精灯火焰的充分燃烧层直至烧红干热灭菌玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等干热
2、灭菌箱内，1601701 h2 h高压蒸汽灭菌培养基等高压蒸汽灭菌锅内100 kPa,12115 min30 min3.微生物的纯化培养平板划线法与稀释涂布平板法 方法平板划线法稀释涂布平板法注意事项(1)接种环的灼烧第一次划线前：接种环上的微生物，避免污染培养物每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管
3、口和移液管应在离火焰1 cm2 cm处(2)涂布平板时涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体方法平板划线法稀释涂布平板法目的在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体菌落培养平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染1微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患 病，但多数微生物对人类是有益的。请回答下列问题。(1)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐
4、。从土壤中分离分解尿素的细菌时，培养基中加的惟一氮源为_，这种培养基称为_培养基。(2)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，为什么要将平板倒置？_。(3)微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和_法。在用平板划线法接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种杯？_ _ _。(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？_。解析：从土壤中分离出分解尿素的细菌，需用选择性培养基，惟一的氮源是尿素。接种过程中，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法两种方法。第一次灼烧接种环是为了杀死接种环上的微生物，防止其他微生物污染培养基。每次划线前都要灼烧接种环的目的是
5、杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落。最后一步需灼烧接种环的目的是灭菌，以免菌种对环境造成污染和感染操作者。答案：(1)尿素 选择(2)培养皿盖上会凝有水珠，防止水珠落入培养皿造成污染，还可使培养基表面的水分更好地蒸发(3)稀释涂布平板 第一次灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落。(4)需要，避免菌种对环境造成污染和感染操作者 1筛选原理 配制选择培养基，把尿素作为培养
6、基中的惟一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长，其他微生物则不能在此培养基上生长。2统计菌落数目(1)理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。(2)计算方法：每克样品中的菌株数(CV)M其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数：V代表涂布平板时所用稀释液的体积(mL)；M代表稀释倍数。(3)统计的菌落往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(4)为使结果接近真实值，要设置
7、重复组，取其平均值。可将同一稀释度的样品加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养计算出菌落平均数。3设置对照 可排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。4实验流程(1)以尿素为惟一氮源的培养基作为实验组，制备牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择作用。(2)以培养基加土壤样品进行培养为实验组，培养基不加土壤样品进行培养为对照组，判断培养基是否被污染。5课题延伸 由于分离分解尿素的细菌的选择培养基上可能生长着以尿素细菌代谢产物为氮源的其他微生物，因此还需借助生物化学方法对分离细菌作进一步鉴定。(1)原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成NH3，使培养基碱性增
8、强，pH升高，因此，可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。(2)方法：在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种菌能分解尿素。2(2009安徽高考)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是 ()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌 后倒平板 B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分 别涂布于各组平板上 C将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养2448小时 D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平 板进行计数 解析：确定对照组无菌后，选择菌落在30300的平板进行计数
9、，D错；A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法，均为正确做法。答案：D 1筛选原理 2实验流程 3刚果红染色的两种方法的比较 先培养微生物，再加入刚果红在倒平板时就加入刚果红优点显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作简便，不存在菌落混杂问题缺点操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；有些微生物具有降解色素的能力，长时间培养会降解刚果红，从而形成明显的透明圈，这些微生物与纤维素分解菌不易区分特别提醒 为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素 酶的实验。纤维素酶
10、的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶的分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌 株数量的多少来确定。3分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是()稀释倒平板法 涂布平板法 单细胞挑取法 选择培养分离 A B C D 解析：分离土壤中纤维素分解菌，先进行培养，再进行梯度稀释，涂布平板培养，单细胞挑取以获得纯培养。稀释倒平板法是先进行梯度稀释，然后分别取不同稀释度的菌悬液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合、摇匀后，倒入已灭菌的培养皿中，制成可能含菌的琼脂平板，培养一定时间后即可出现菌落。涂布平板法是先将
11、熔化的培养基倒入无菌培养皿中，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的菌悬液涂布在整个平板表面，经培养后形成单个菌落。答案：B(1)从近几年新课标地区生物试题看，“微生物的培养与利 用”考点无疑是选修1中近几年新课标高考的最大热点，如2010山东卷T34、2009宁夏卷T40、2009安徽卷T9、2008山东卷T34(2)(4)和广东卷T38等都考查了微生物的分离和培养技术。2008山东卷T34(3)、2007山东卷T34(3)和宁夏卷T32(3)(5)都考查了选择培养基的作用。命题角度 微生物的分离与培养(2)微生物的分离、纯化和培养过程是微生物工程应用的基 础，是近几年新课标高考的
12、重要考点和热点，预计在2012年的高考中还会有所涉及。现在大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地产生大量的废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源乙醇。如图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工艺流程，请回答相关问题：(1)自然界中环节需要的微生物大多分布在_的环 境中。将从土壤中获得的微生物培养在以_为碳 源、并加入_的培养基上，筛选周围有_ 的菌落。(2)在如上所述的筛选过程中获得了三个菌落，对它们分别 培养，并完成环节，且三种等量酶液中酶的浓度相 同，则你认为三种酶液的活性_(一定相同、不一 定相同、一定不同)，可以通过_ 进行定量测定。(3)根据测定结果，环
13、节常选择木霉，则中获得的酶是 _酶。(4)生产中可以满足环节的常见菌种是_，为了确保 获得产物乙醇，环节要注意_ _。(5)该技术虽然有广阔的前景，但存在酶的成本高等问题，为 了降低成本可利用_等技术使酶能够重复利用。解析(1)富含纤维素的土壤中，含有大量以纤维素为碳源的纤维素分解菌。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素分解后，复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过此方法来筛选纤维素分解菌。(2)酶液中蛋白质的浓度相同，酶的活性不一定相同，可通过分解纤维素后所产生的葡萄糖量是否相等来鉴定其活性是否相同。(3)木霉能产生纤维素酶，可以将纤维素分解。(4)在
14、酒精发酵中常用的微生物是酵母菌，在接种过程中一定要避免杂菌污染。乙醇是酵母菌无氧发酵的产物，发酵过程中一定要保持无氧的环境。(5)可通过固定化酶技术使酶能够反复利用来降低酶的成本。答案(1)富含纤维素(其他答案合理也可，如落叶较多等)纤维素 刚果红 透明圈(2)不一定相同 对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖(3)纤维素(4)酵母菌 发酵装置的密闭性(或保证无氧条件等)(5)固定化酶 1(2010重庆高考)炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜 共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离
15、培养，获得可疑菌落。(2)细菌鉴定：实验流程如图所示：对配制的液体培养基等需采取_方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为_(填“无机碳”或“有机碳”)。挑选可疑菌落制片后，用_观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。接种可疑菌后，35培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是_。对照组试管中应加入_，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组_(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。对排除的疑似患者及易感人群，可接种炭疽杆菌疫苗，刺激机体产生相应抗体，与产生抗体相关的细胞除T细胞、B细胞外，还有_。解析：培养基应用高压蒸汽方法进行灭菌。炭疽杆菌同化类型为异养型，应
16、选有机碳作为其碳源。微生物个体小，肉眼观察不到，必须借助显微镜才能观察到菌体特征。在液体培养基中，细菌大量繁殖会导致培养液变浑浊；该实验中实验变量为是否加入噬菌体，所以对照组除不加噬菌体外，其他处理都应该和实验组保持一致(即应加入不含噬菌体的生理盐水)。噬菌体可破坏细菌细胞，从而使培养液变清。在特异性免疫的感应阶段，吞噬细胞参与了抗原的呈递，浆细胞是直接产生抗体的细胞。答案：(2)高压蒸汽(100 kPa蒸汽)有机碳 显微镜 细菌大量繁殖 等量生理盐水 低 吞噬细胞、浆细胞 2(2009宁夏高考)(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营 养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小
17、、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行_(消毒、灭菌)；操作者的双手需进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_ _ _。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。解析：消毒一般只是消灭体表的微生物，而灭菌会杀灭物体内外所有微生物包括芽孢和孢子等。细菌等微生物的有无通常是通过培养来观察包括菌落的形状、颜色等。答案：(1)温度 酸碱度 易培养 生活周期短(2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构(3)比例合适(4)鉴定(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。(6)灭菌
