1、 学案49 DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序考纲要求1.基因工程的诞生2.基因工程的原理及技术 复习要求1理解基因工程的实质2理解基因工程操作的四步曲及其操作实例基础自查一基因工程的概念基因工程是指 ，通过 技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出 。基因工程是在 水平上进行设计和施工的，又叫做 。二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶（限制酶）（1） 。（2）功能： 。（3）结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式： 。2. DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：相同点： 。区别：（2）与DNA聚合酶作用的异同: 3.载体（1）载
2、体具备的条件：（2）最常用的是 其它载体： 三基因工程的基本操作程序第一步： . 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有 。.PCR技术扩增目的基因（1）原理： （2）过程： 。第二步： 1.目的： 。2.组成： （1）启动子： 。（2）终止子： 。（3）标记基因的作用： 。第三步： 2.常用的方法：a、将目的基因导入植物细胞方法： 。b、将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 。此方法的受体细胞多是 。C、将目的基因导入微生物细胞：最常用的原核细胞是 ，其转化方法是： 。第四步： 1.首先要检测 ，方法是采用 。2.其次还要检测 ，方法是采用 。3.最后检
3、测 ，方法是 ，用 。4.有时还需进行 的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。课堂深化探究一对基因工程概念的理解别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 与杂交育种相比 与诱变育种相比 原理 二基因工程的基本操作工具1与DNA分子相关的酶(1)几种酶的比较种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物 作用部位 作用特点 作用结果 (2)限制酶与DNA连接酶的关系 2载体(1)作用 (2)具备的条件(3)种类特别提醒一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。限制酶切割位点所处的位置必
4、须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。三基因工程操作程序基因工程技术生产凝乳酶的过程1基因工程的操作程序分析(1)目的基因的获取途径 (2)基因表达载体的构建特别提醒插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。(3)将目的基因导入受体细胞(转化)生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程 (4)目的基因的检测与鉴定类型检测内容方法结果显示分子检测导入检测 转录检测 翻译检测 个体水平检测 特别
5、提醒：1在整个工程中，只有第三步将目的基因导入受体细胞过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生配对。2切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，利于基因表达载体的构建。3插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。4PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段
6、形成整个DNA分子对应训练1.下列关于基因工程的叙述，错误的是( )A目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达2.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()。A一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性核酸内切酶的活性受温度影响C限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD限制性核酸内切酶可从原核生物中提取3.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst 、Sma 、
7、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是()。A图示过程是基因工程的核心步骤B表达载体构建时需要用到限制酶 SmaC抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构4.下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是()A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达限时训练题组一基因工程及基
8、本操作1.科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内表达成功。请根据图回答问题:(1)此图表示的是采取 合成基因的方法获取 基因的过程。 (2)图中DNA是以 为模板， 形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的基因。 (3)图中代表 DNA，含 基因。 (4)图中表示 。2下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A B C D3下列关于基因工程的叙述，不正确的是(多选)()A基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B细菌质粒是基因工程常用的运载体C通常用
9、一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理运载体DNA D为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体题组二基因工程的操作程序4.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。(1)若限制酶的识别序列和切点是GATC，限制酶识别序列和切点是GGATCC，那么在过程中，应用限制酶_切割质粒，用限制酶_切割抗虫基因。(2)将通过过程得到的大肠杆菌涂布在含有_的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为：_。经筛选分
10、析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的_。(4)过程所用的现代生物技术称为_，从遗传学角度来看，据细胞通过过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有_。5干扰素是病毒侵入人体后由淋巴细胞产生的一种免疫活性物质，它具有广谱抗病毒的作用。利用现代生物技术生产干扰素的流程如下：(1)过程产生的物质A是_，cDNA文库_(大于/小于)人的基因组文库。(2)过程用到的工具酶是_，过程需先用_处理受体细胞，过程通常采用_技术。(3)过程和的关键技术分别是_、_。(4)基因工程的核心步骤是图中的_(填标号)
11、。题组三综合题6.(2011安徽理综31)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。(1)进行转基因操作前，需用_酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的_和_之间。(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、_和_。(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以_，增
12、加培养的细胞数量，也有利于空气交换。7(2010天津理综，7)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamH、Hind、Sma直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答问题。(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用_限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含_的培养基上进行。(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是_(填字母代号)。A启动子 BtetR C复制原点 DampR(3)过程可采用的操作方法是_(填字母代号)。A农杆菌转化 B大肠杆菌转化C显微注射 D细胞融合
13、(4)过程采用的生物技术是_。(5)对早期胚胎进行切割，经过程可获得多个新个体。这利用了细胞的_性。(6)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用_(填字母代号)技术。A核酸分子杂交 B基因序列分析C抗原抗体杂交 DPCR8(2009上海卷)人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。(1)目的基因的获取方法通常包括_和_。(2)上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改变的碱基对，这种变异被称为_。(3)已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部
14、分区域(见上图)，那么正常人的会被切成_个片段，而患者的则被切割成长度为_对碱基和_对碱基的两种片段。(4)如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460个碱基对的四种片段，那么该人的基因型是_(以P表示正常基因，P表示异常基因)。9(2009福建卷)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答下列问题。(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_，对_进行切割。(2)培养板中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有_，作为
15、标记基因。(3)香蕉组织细胞具有_，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_。高考真题体验1.（2013江苏卷，22）小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达。下列相关叙述正确的是（多选）A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞 2.(2013安徽卷，6） 下图为通过
16、DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是A 根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目B 外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制C 重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接D 放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置3.（2013新课标卷，40）【生物选修3 现代生物科技专题】（15分）阅读如下材料：材料甲：科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵在，得到了体型巨大的“超级小鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。材料乙：T4溶菌酶在温度较高时易失去活性，科学家对编码T4溶菌酶的基因进行
17、改造，使其表达的T4溶菌酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97为的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。材料丙：兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体，科学家将兔甲受精卵发育成的胚胎移植到兔乙的体内，成功产出兔甲的后代，证实了同一物种的胚胎可在不同个体的体内发育。回答下列问题：（1）材料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用 法。构建基因表达载体常用的工具酶有 和 。在培育转基因植物是，常用农杆菌转化发，农杆菌的作用是 。（2）材料乙属于 工程范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对 进行改造，或制造制造一种 的技
18、术。在该实例中，引起T4溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的 序列发生了改变。（4）材料丙属于胚胎工程的范畴。胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到 种的、生理状况相同的另一个雌性动物体内，使之继续发育成新个体的技术。在资料丙的实例中，兔甲称为 体，兔乙称为 体。4.（2013北京卷，30）（18分）斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验（1）在上述转基因实验中，将G基因与
19、质粒重组，需要的两类酶是 和 。将重组质粒显微注射到斑马鱼 中,整合到染色体上的G基因 后，使胚胎发出绿色荧光。（2）根据上述杂交实验推测：亲代M的基因型是 （选填选项前的符号）。 a. DDgg b. Ddgg子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括 （选填选项前的符号）。 a. DDGG b. DDGg c. DdGG d. DdGg（3）杂交后，出现红绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代 （填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的 发生了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子占其全部配子的比
20、例，算式为 5.(2013广东卷，28）（16分）地中海贫血症属于常染色体遗传病。一对夫妇生有一位重型地中海贫血症患儿，分析发现，患儿血红蛋白链第39位氨基酸的编码序列发生了突变（CT）。用PCR扩增包含该位点的一段DNA片段l，突变序列的扩增片段可用一种限制酶酶切为大小不同的两个片段m和s；但正常序列的扩增片段不能被该酶酶切，如图11（a）。目前患儿母亲再次怀孕，并接受了产前基因诊断。家庭成员及胎儿的PCR扩增产物酶切电泳带型示意图见图11（b）。（终止密码子为UAA、UAG、UGA。）（1）在获得单链模板的方式上，PCR扩增与体内DNA复制不同，前者通过_解开双链，后者通过_解开双链。（2
21、）据图分析，胎儿的基因型是_（基因用A、a表示）。患儿患病可能的原因是_的原始生殖细胞通过_过程产生配子时，发生了基因突变；从基因表达水平分析，其患病是由于_。（3）研究者在另一种贫血症的一位患者链基因中检测到一个新的突变位点，该突变导致链第102位的天冬酰胺替换为苏氨酸。如果_，但_，则为证明该突变位点就是这种贫血症的致病位点提供了一个有力证据。6.（2013上海卷）（六）回答下列有关遗传信息传递和表达的问题。（9分） 图17表示利用致病病毒M的表面蛋白基因和无害病毒N，通过基因工程制作重组M病毒疫苗的部分过程。其中表示操作流程，ah表示分子或结构。据图回答问题。56基因工程除了微生物基因工
22、程外，还有_。在图17所示过程中，获取目的基因的步骤是流程 （用图中编号回答）；在流程中必需实施的步骤有_。57在图17所示的整个过程中，用作运载体的DNA来自分子_（用图中字母回答）。58下列关于质粒运载体的说法正确的是_（多选）。A使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解B质粒运载体只能在与目的基因重组后进入细胞C质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的D质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则E质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达F没有限制酶就无法使用质粒运载体59据图比较结构g和结构h的异同，并解释产生差异的原因_。 7(2012浙江高考)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由
23、于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（ ）A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞8. (2012高考全国新课标卷40)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）限制性内切酶切割分子后产生的片段，其末端类型有和。（2）质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下：为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR
24、切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是。（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即DNA连接酶和DNA连接酶。（4）反转录作用的模板是，产物是。若要在体外获得大量反转录产物，常采用技术。（5）基因工程中除质粒外，和也可作为运载体。（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是。9.(2012福建高考)现代生物科技专题。肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实验表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图。请回答：（）
25、进行过程时，需用 酶切开载体以插入let-7基因。载体应用RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为 。（）进行过程时，需用 酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。（）研究发现，let-7基因能影响RAS的表达，其影响机理如图。据图分析，可从细胞提取 进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中 （RASmRNA/RAS蛋白）含量减少引起的。10 (2012天津高考7)生物分子间的特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质-DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：（1）过程酶作用的部位是
26、 键，此过程只发生在非结合区DNA，过程酶作用的部位是 键。（2）、两过程利用了酶的 特性。（3）若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要过程的测序结果与 酶的识别序列进行对比，以确定选用何种酶。（4）如果复合体中的蛋白质为RNA酶聚合，则其识别、结合DNA序列位基因的 。（5）以下研究利用了生物分子间的特异性结合的有 （多选）A.分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNA B.用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体定位D将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟。11.
27、 (2012江苏高考32)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题 （1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 连接。（2）若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma I完全切割，
28、产物中共有 种不同长度的DNA片段。（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。12(2011四川理综，5)北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是()。A过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，
29、不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白C过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达13.（2011 浙江）将ada（腺苷酸脫氨酶基因）通过质粒pET28b导人大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是（）A每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子 14(2010全国，5)下列叙述符合基因工程概念的是()。AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B将
30、人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上15(2010浙江理综，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()。A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C将重组DNA分子导入烟草原生质体D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞16(2010江苏卷)下列关于转基因植物的叙述，正确的是()。A转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中B转抗虫基因的植物，不会导致昆虫
31、群体抗性基因频率增加C动物的生长激素基因转入植物后不能表达D如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题17(2009浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()。A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达学案49 DNA重组技术的基本工具和基因工程的基本操作程序答案与解析基础自查一基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的
32、新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。二基因工程的基本工具1.限制性核酸内切酶（限制酶）（1）主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有专一性。（3）结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2. DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而
33、T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。（2）与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。3.载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的是质粒, 其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 三基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取. 反转录法和化学合成法 .PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程： DNA解链；引物结合到互补DNA
34、链，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。（3） 鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞 2.常用的方法：a、 农杆菌转化法 基因枪法和 花粉管通道法等。b、 显微注射技术 受精卵。C、 大肠杆
35、菌 先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。第四步：目的基因的检测和表达1.转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交技术。2.目的基因是否转录出了mRNA 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。3.目的基因是否翻译成蛋白质 转基因生物中提取蛋白质 抗体进行抗原抗体杂交。4.个体生物学水平的鉴定。 课堂深化探究一对基因工程概念的理解别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因
36、产物与杂交育种相比克服远缘杂交不亲和的障碍与诱变育种相比定向改造生物性状原理基因重组二基因工程的基本操作工具1与DNA分子相关的酶(1)几种酶的比较种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末
37、端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子(2) 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶起作用时不需要模板。2载体(1)作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2) 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。具有特殊的标记基因，以便进行筛选。(3)质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。噬菌体的衍生物。动植物病毒。三基因工程操作程序1(1)目的基因的获取途径从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因组文库或cDNA文库中获取
38、。人工合成目的基因常用的方法有反转录法和化学合成法。利用PCR技术扩增目的基因通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。(2)基因表达载体的构建(3)将目的基因导入受体细胞(转化)生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(4)目的基因的检测与鉴定类型检测内
39、容方法结果显示分子检测导入检测目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)杂交带转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交(DNA和mRNA之间)杂交带翻译检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交杂交带个体水平检测包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同对应训练1. 【答案】D【解析】基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。工具酶本质为蛋白质，载体本质为小型DNA分子，但不一定是环状。标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因，表达产物为带颜色物质等。受
40、体细胞中常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物大肠杆菌、酵母菌等。一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定能用哺乳动物成熟红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。2. 【解析】考查基因工程中工具酶的有关知识。限制性核酸内切酶的化学成分是蛋白质，它的活性受到温度和pH的影响；限制性核酸内切酶的特点是能识别双链DNA中特定的核苷酸序列，可在特定的位点进行切割，但不能识别和切割RNA；限制性核酸内切酶主要是从原核生物体内分离出来的。【答案】C3. 【答案】B【解析】图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此
41、时要用到限制酶Pst、EcoR。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。4. 【答案】B【解析】过程中通过逆转录法获得的目的基因，可用于基因工程，但该目的基因中不存在内含子和非编码序列，因此不能用于比目鱼的基因组测序；将多个抗冻基因编码区相连形成的能表达的新基因可能不再是抗冻基因；利用农杆菌的目的是将重组质粒导入受体细胞，而不是筛选重组质粒；应用DNA探针技术，可以检测受体细胞中是否成功导入了目的基因，但不能检测目的基因是否完全表达。限时训练题组一基因工程及基本操作1【答案】(1)人工胰岛素原目的 (2)胰岛素原信
42、使RNA 逆转录 (3)重组 胰岛素原 (4)将重组DNA分子导入受体细胞【解析】本题是对基因工程操作程序的考查。操作时，首先要获取目的基因，然后让目的基因与载体结合构建成重组DNA分子，再通过一定方法把重组DNA分子导入受体细胞使其扩增和表达2【答案】C【解析】限制酶可在特定位点对DNA分子进行切割；DNA聚合酶在DNA分子复制时将脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链；DNA连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起；解旋酶的作用是将DNA双链解开螺旋，为复制或转录提供模板。3【答案】ACD【解析】基因工程经常以抗菌素抗性基因为标记基因；质粒是基因工程常用的运载体；通常用同一种限制酶切割目的基因和运
43、载体，以获得相同的黏性末端；受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。D为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体题组二基因工程的操作程序4. 【答案】(1)(2)四环素(3)让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状(4)植物组织培养发育成完整个体的全部遗传物质【解析】本题极易出错的部分有：在第(1)小题中没有看清目的基因插入的位置，从而不能确定用限制酶还是来切割质粒还是切割抗虫基因。第(3)小题检测抗虫性状在个体水平上是否表达，应该让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，这个地方也有出错的，主要没有看清是在哪个水平上进行检测的。在切
44、割质粒时应遵循一个原则：不能同时将两个标记基因切开，至少保留一个，所以只能用酶切割，而从目的基因两侧碱基序列可知，只能用酶才得到含目的基因的DNA片段。如果导入了重组质粒，此时重组质粒中四环素抗性基因能正常表达，而氨苄青霉素抗性基因已被破坏，所以涂布在含有四环素的培养基上，能够生长的话，说明导入了重组质粒(普通质粒)。如果把携带一个抗虫基因的DNA片段看作杂合子，可以认为是Aa，自交产生的F1中仍具有抗虫特性的植株占总数的比例为。把一个细胞培养成一个植株的技术称为植物组织培养。5. 【答案】（1）mRNA 小于（2）限制性内切酶 DNA连接酶 钙离子 显微注射（3）胚胎移植 核移植（4）【解析
45、】(1)cDNA来自mRNA的逆转录或根据mRNA的碱基序列人工合成，cDNA文库小于基因组文库。(2)构建基因表达载体用到限制酶和DNA连接酶。将目的基因导入大肠杆菌须用Ca2处理受体细胞；导入动物细胞用显微注射法。(3)过程的关键技术是胚胎移植，过程的关键技术是细胞核移植。(4)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即。题组三综合题6. 【答案】(1)胰蛋白(或胶原蛋白)(2)启动子终止子(3)对干扰素基因特异的DNA引物对TaqDNA聚合酶(4)扩大细胞贴壁生长的附着面积 【解析】本题综合考查基因工程、细胞工程和PCR技术，意在考查考生对基础知识的理解。胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理可以将动
46、物组织分解成单个细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子有利于目的基因的表达，标记基因有利于目的基因的检测；PCR技术中需要原料(4种脱氧核苷酸)、缓冲液、模板DNA、引物和耐热DNA聚合酶等；在生物反应器中放入多孔的中空薄壁小玻璃珠的目的：一方面有利于细胞的贴壁生长，避免接触抑制；另一方面有利于气体交换。7. 【答案】(1)Hind和BamH氨苄青霉素(2)A(3)C(4)胚胎移植技术(5)全能(6)C【解析】(1)由图示可知：需用Hind和BamH限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后tetR四环素抗性基因结构被破坏而ampR氨苄青霉素抗性基因结
47、构完好，故用含氨苄青霉素的选择培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。(2)启动子是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可调控基因的特异性表达。(3)过程表示把重组载体导入受体细胞的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射法。(4)过程表示把早期胚胎移植到代孕母牛子宫的过程，属于胚胎移植技术。(5)经过程得到新个体是细胞全能性的体现。(6)人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表达产物即人乳铁蛋白，可用抗原抗体杂交法检测该蛋白是否存在。8. 【答案】(1)从细胞中分离通过化学方法人工合成(2)见下图基因碱基对的替换(基因突变)(3)3460220(4)PP【解析】本题主要
48、考查基因工程相关知识。(1)目的基因的获取方法有直接分离和化学方法人工合成两种；(2)仔细对比正常人与患者的基因序列可知是CG碱基对变为了TA碱基对，这种变化属于基因突变；(3)正常人P53基因有两个限制酶E的识别序列，完全切割后可产生三个片段，患者P53基因中有一个限制酶E的识别序列发生突变，且突变点位于识别位点内，这样患者就只有一个限制酶E的识别序列，切割后产生两个片段，分别为290170460对碱基，220对碱基；(4)正常人的P53基因经限制酶E完全切割后产生三个片段，290对碱基、170对碱基和220对碱基，患者产生两个片段460对碱基和220对碱基，则该人的基因型应为PP。9.【答
49、案】(1)Pst、EcoR含抗病基因的DNA、质粒(2)抗卡那霉素基因(3)全能性脱分化、再分化【解析】本题考查基因工程的有关知识。(1)从图可看出，只有Pst、EcoR两种酶能保持抗病基因结构的完整性，所以构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶Pst、EcoR两种酶，对抗病基因的DNA和质粒进行切割。(2)卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有抗卡那霉素基因，以此作为标记基因。(3)香蕉组织细胞具有全能性，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中、依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的脱分化和
50、再分化。高考真题体验1.【答案】BD【解析】设计引物时应当与表达载体两端的序列进行互补配对A错误；PCR法扩增目的基因只需要知道基因两端的序列设计合适的引物即可，而不必知道其全部序列，B正确；PCR中应用耐高温的DNA聚合酶C错误；根据目的基因的编码产物选择合适的受体细胞，以有利于基因的表达，D正确，因此答案为BD。【试题评价】本题主要考查基因工程中PCR技术等相关知识，旨在考查学生的理解分析能力。2.【答案】D【解析】稀释涂布平板法可以测定活菌数量，但如果菌种之间的距离较小时会有多个活菌种共同形成一个菌落的现象，菌落数只能大约推测出活菌数，不能准确计算活菌数，A错误；外源DNA作为一个完整的
51、基因，自身含有启动子和终止子，B错误；所有DNA分子都是脱氧核糖和磷酸交替连接，是共性，不同的碱基序列才是DNA分子的特异性，DNA分子杂交原理是相应碱基序列的互补配对，C错误；通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆。因为放射性标记的DNA探针能与相应的DNA杂交，而产生放射自显影，而只有特定的DNA才与探针相结合，所以可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，D正确。【试题点评】本题主要考查细菌培养和基因工程等有关知识，选修内容回归选择题，难度适中。3.【答案】（1）显微注射法 限制性内切酶 DNA连接酶 农杆菌可感染植物，将目的基因转移到受体细胞中 （2）蛋白质 现有蛋白质
52、 新蛋白质 氨基酸 （3）同 供体 受体 【解析】(1)将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法，构建基因表达载体常用的工具酶是限制性内切酶和DNA连接酶。农杆菌的作用是将目的基因导入到植物（受体）细胞内。 （2）资料乙中的技术属于蛋白质工程的范畴，该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过对基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质的技术。在该实例中，引起T4溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的氨基酸序列发生了改变。 （3）胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的另一个雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。在资料丙实例中，兔甲称为供体，兔乙
53、称为受体。【试题点评】本题通过基因工程和胚胎工程知识结合，主要考查对基础知识的理解和识记能力。4.【答案】（1）限制性核酸内切酶 DNA连接酶 受精卵 表达（2）b b、d（3）N 非姐妹染色单体 4（红绿荧光胚胎数量/胚胎总数） 【解析】（1）基因工程操作过程中需要两类工具酶：限制性核酸内切酶DNA连接酶。动物细胞工程的受体细胞一般是受精卵。 （2）由于出现了绿色荧光（D_G_）和红色荧光（ddgg）的子代胚胎，则亲代M中必定均含有d基因，同时可推出M和N的基因型是：Ddgg、DdGg，由此可知第一问选b，第二问选b、d。 （3）由题可知，D与G是连锁遗传的，再由第（2）题的分析可知，其基因
54、分析如下图（左）所示，因此正常情况不会产生红绿荧光胚胎，除非亲代N的在减数分裂过程中同源染色体发生了交叉互换，形成如下图（右）所示的情况。交叉互换后 若亲代N产生的配子中重组的配子（dG和Dg）占的比例为x，则dG占的比例为x/2，又因亲代M产生两种比例相等的配子：Dg、dg，则可知子代胚胎中红绿荧光胚胎的概率为x/4，即：x/4=（红绿荧光胚胎数量/胚胎总数），可推出重组的配子比例为：4红绿荧光胚胎数量/胚胎总数。【点评】考查基因工程、基因的自由组合定律和减数分裂等知识，以及理解能力、获取信息的能力、实验探究能力和综合运用能力。命题材料和角度都非常新颖，又恰当地处理好了新题与难题的关系。既很
55、好地体现了跨模块结合的新要求，又充分体现了理科综合能力测试的魅力。5.【答案】（1）高温 解旋酶 Aa 母亲 减数分裂 突变后终止密码子提前出现，翻译提前终止形成异常蛋白该病可遗传给后代 患者的链不能被限制性酶切割【解析】（1）PCR是体外扩增DNA的方式，通过高温的使双链解开，体内DNA的复制则是通过解旋酶使DNA双链解开。（2）由题意可知重度地中海贫血是隐性遗传病，突变后的序列可以被剪切成m和s的两个片段，而正常序列无法被剪切，因此母亲、父亲、患儿和胎儿的基因型分别为：AA、Aa、aa和Aa，母亲和父亲的基因型为AA和Aa，生下患儿可能是因此母亲的原始生殖细胞通过减数分裂产生配子时发生了基
56、因突变。由图可知，其突变为由模板链的CTC突变成ATC，mRNA上由GAG变成UAG，因此终止密码子提前出现，使翻译提前终止。（3）如果这种贫血病可以遗传给后代，而又能证实不是重型地中海贫血，即链不能被限制性酶切割，则为证明该突变位点就是这种贫血病的致病点提供了有力证据。【考点定位】本题以信息题的形式综合考查了pcr, DNA复制，基因突变，减数分裂等相关知识点及其内在联系和应用，而且第三问则考察学生发散性思维的能力，运用知识解决问题的能力，具有一定的创新性。题目个别问题难道较大。6. 【答案】56.植物基因工程、动物基因工程 、 切割质粒、将质粒与目的基因重组 57.c、d 58.A、D、F
57、 59.相同点：遗传物质相同；不同点：表面蛋白质不同。差异的原因：因为g导入受体细胞后，目的基因得以表达，合成了致病病毒M的表面蛋白7【答案】A【解析】提取矮牵牛蓝色花的mRNA，逆转录得到DNA，然后扩增，可获得大量的基因B，A正确；从基因文库中获取目的基因，只要根据目的基因的相关信息和基因文库中的信息进行筛选对比即可，不需要用限制酶进行切割，B错误；目的基因与质粒的连接需要用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶，C错误；目的基因需要和运载体连接后形成重组质粒再导入，而且应该用农杆菌进行感染，而不是大肠杆菌，D错误。8.【答案】（1）黏性末端 平末端（2）切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产
58、生的相同（3）Ecoli T4（4）mRNA（RNA） cDNA （DNA） PCR（5）噬菌体 动植物病毒等（6）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱【解析】（1）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。（2）为使运载体与目的基因相连，不同的限制酶应切割出相同的黏性末端，它们必须要能识别相同的核苷酸序列，并且使每条链中相同的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。（3）DNA连接酶，根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为Ecoli DNA连接酶；另一类是
59、从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。（4）反转录是以RNA为模版来合成DNA的过程。可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR（多聚酶链式反应）（5）基因工程中除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。（6）大肠杆菌细胞外有细胞壁和细胞膜，能阻止其他物质的进入，只能通过Ca2+处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。9.【答案】（10分）（1）限制性核酸内切酶（或限制） 启动子（2）胰蛋白（3）RNA RAS蛋白【解析】（1）过程表示基因表达载体的构建，在该过程中需要用限制酶对载体进行切割以便于目的基因的插入（限制性核酸内切酶，简称限
60、制酶，写其他的不得分）；启动子是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶结合和识别的位点，RNA聚合酶结合到该位点，可驱动转录过程。（2）过程表示动物细胞培养，培养过程中出现接触抑制后可以用胰蛋白酶处理，使之分散成单个的细胞，之后分装到其他培养瓶里面进行传代培养。（3）判断目的基因是否在受体细胞中转录，可用分子杂交技术来进行，从细胞中提取mRNA和用放射性同位素或者荧光标记的目的基因单链DNA片段进行杂交。根据题中信息“肺组织细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达就增强，引发肺癌”导入let7基因后，肺癌细胞受到抑制，说明RAS基因表达减弱，导致细胞中的RAS蛋白质含量减少进而导致癌细胞
61、受抑制。10【答案】（1）磷酸二酯键，肽键（2）专一（3）限制性核酸内切酶 （4）启动子（5）ACD【解析】（1）DNA酶作用的部位是DNA的磷酸二酯键，蛋白酶作用的部位是肽键。（2）过程利用了各种酶催化一种或一类化学反应的特性，即专一性。（3）DNA要构建重组质粒，需要用限制性核酸内切酶切割，再与质粒重组。（4）RNA聚合酶识别和结合在基因的启动子上，驱动基因转录。（5）蛋白酶能特异性的酶解蛋白质，分子杂交手段也是利用各物质分子结合的特异性，抑制成熟基因转录出的mRNA与催化成熟酶基因的mRNA碱基互补结合，也具有特异性，光和色素易溶于有机溶剂，与酒精并不是特异性的溶解，所以选ACD。11【
62、答案】（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖（2）平 537bp、790bp、661bp （3）4（4）BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接【解析】（1）DNA单链中相邻两个碱基之间通过“脱氧核糖磷酸脱氧核糖”连接。（2）Sma I识别的序列为GGGCCC，切割后会产生平末端；图1所示的DNA分子中含有两个Sma I的识别位点，第一个识别位点在左端534bp序列向右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658bp序列向左三个碱基对的位置，从这两个位点切割后产生的DNA片段长度分别为534+3，796-3-3，658+3，即得到的DNA片段长度分别为537b
63、p、790bp和661bp。（3）在杂合子体内含有基因D和基因d，基因D的序列中含有两个识别位点，经过SmaI完全切割会产生537bp、790bp和661bp三种不同长度的片段，基因d的序列中含有一个识别位点，经过切割后会产生1327bp和 661bp两种长度的片段，综上，杂合子中分离到该基因的DNA片段经过切割后会产生4种不同长度的片段。（4）能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamH I和识别序列为GATC的Mbo I，若使用Mbo I会同时破坏质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamH I来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因
64、，便于筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。因为目的基因和运载体是用同种限制酶切割的，目的基因两端的末端和质粒切割后的两个末端都能进行互补，可能出现目的基因反向连接在运载体上的情况，导致基因D不能正确表达。12. 【答案】B 【解析】将多个抗冻基因编码区相连成能表达的新基因，合成的蛋白质为新的蛋白质，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白，故选项B正确；过程是利用反转录法合成目的基因，由于没有非编码区和编码区中的内含子，不能用于比目鱼基因组测序；用作载体的质粒，必须具有标记基因才能便于检测和筛选；应用DNA探针技术，可检测转基因抗冻番茄中目的基因的存在和转录，但不能检测是否成功表达，故选项A、C、D错误。13.
65、【解析】受体大肠杆菌成功表达腺苷酸脱氨酶，说明每个大肠杆菌细胞至少含有一个重组质粒，且每个ada至少指导合成一个腺苷酸脱氨酶分子。重组质粒的形成需先用限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒形成相同的黏性末端，再在DNA连接酶的作用下连接起来，连接起来的序列中会 含有限制性核酸内切酶的识别位点。不同的限制性核酸内切酶识别位点不同，不是每个限制性核酸内切酶的识别位点都能插入ada，C项错误。【答案】C14. 【答案】B 【解析】基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的
66、基因产物。所以B为基因工程，而A为动物细胞工程，C为诱变育种，D无人为因素不属于基因工程。15. 【答案】A【解析】限制性核酸内切酶用于提取目的基因和切割载体，烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，不能用限制性核酸内切酶切割，A项错误；DNA连接酶可以连接具有相同黏性末端的目的基因和载体，B项正确；受体细胞可以是受精卵和体细胞，也可以是去除细胞壁的原生质体，C项正确；目的基因为抗除草剂基因，所以未成功导入目的基因的细胞不具有抗除草剂的能力，筛选时应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，D项正确。16. 【答案】A 【解析】抗除草剂基因导入到油菜的染色体后则可以通过花粉传入环境中；转抗虫基因的植物可杀死无抗性昆虫，对昆虫的抗性具有选择作用，所以会导致昆虫群体抗性基因频率增加；转基因技术打破了生殖隔离，动物的生长激素基因转入植物后可以表达；来源于自然界的目的基因导入植物体后，可能破坏原有的基因结构，具有不确定性，外源基因也可能通过花粉传播，使其他植物成为“超级植物”等，所以转基因技术存在着安全性问题。17【答案】D【解析】载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞，但由于它和目的基因是相互独立的，并不能促进目的基因的表达。