1、课题3 血红蛋白的提取和分离学 习 目 标知 识 体 系1.说出分离蛋白质的基本方法。2.说出凝胶色谱法、电泳法等分离蛋白质的基本原理。3.尝试运用凝胶色谱法对血液中的血红蛋白进行提取和分离。(重点、难点)01 探新知 自主梳理02 破重难 讲练互动03 固双基 当堂达标04 课后 巩固提升一、基础知识1蛋白质的分离依据蛋白质特性的差异，如分子的形状和、所带的性质和多少、溶解度、和对其他分子的亲和力等。大小电荷吸附性质2凝胶色谱法(1)概念：也称作，是根据分离蛋白质的有效方法。(2)凝胶的特点形态：微小的组成：大多数由构成结构：内部有许多(3)常用凝胶：和琼脂糖。分配色谱法相对分子质量的大小多
2、孔球体多糖类化合物贯穿的通道葡聚糖(4)分离原理分离物质通道路程速度相对分子质量较大凝胶外部较快相对分子质量较小较长较短凝胶内部较慢3.缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(2)配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得的缓冲液。(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持与体内环境中的pH基本一致。外界的酸和碱使用比例在不同pH范围内使用体外溶液的pH4电泳(1)概念：带电粒子在的作用下发生的过程。(2)原理带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。迁
3、移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其的电极移动。分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生，从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用的电泳方法：电泳和电泳。电场迁移可解离正电或负电所带电荷相反带电性质的差异大小形状不同的迁移速度琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶二、实验操作1样品处理(1)红细胞的洗涤目的：去除。方法：。标准：直至上清液不再呈现。(2)血红蛋白的释放红细胞加入到原血液的体积 加入40%体积的甲苯磁力搅拌器上搅拌 min,血红蛋白释放。杂蛋白低速短时间离心黄色蒸馏水10(3)分离血红蛋白溶液方法：混合液r/min离心min分层。分层结果(自上
4、而下)第 1 层：无色透明的。第 2 层：脂溶性物质的白色薄层固体。第 3 层：的水溶液透明液体。第 4 层：其他杂质的暗红色沉淀物。结果处理：将试管中的液体用过滤，除去沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的液体。2000 10 甲苯层沉淀层血红蛋白红色滤纸脂溶性红色透明2透析粗分离(1)过程：取1 mL的溶液装入中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的中(pH为7.0)，透析12 h。(2)原理：透析袋能使自由进出，而将保留在袋内。(3)目的：去除样品中的杂质。血红蛋白透析袋磷酸缓冲液小分子大分子相对分子质量较小3凝胶色谱操作纯化(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色
5、谱柱的装填：凝胶用充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，缓慢倒入凝胶色谱柱内(3)样品的加入加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面，关闭出口加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的，注意不要破坏凝胶面加样后：打开下端出口，使样品渗入内(4)洗脱：下端出口，加入磷酸缓冲液，连接，下端出口，进行洗脱蒸馏水一次性平齐顶端凝胶床关闭缓冲液洗脱瓶打开4纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是。蛋白质纯度SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳三、操作提示1红细胞的洗涤：、离心速度与十分重要。洗涤次数过少，无法除去蛋白；离心速度过高和时
6、间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。2色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。3凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的，降低。4蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。洗涤次数离心时间血浆洗脱液洗脱次序分离效果预习小测1想一想洗涤红细胞和血红蛋白的释放所用的液体分别是什么？提示：生理盐水和蒸馏水。2判一判(1)凝胶色谱法和电泳法分别利用了蛋白质的相对分子质量的大小和所带电荷性质不同实现了对蛋白质的分离()(2)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较小的蛋白质因质量
7、较小而运动速度更快()(3)缓冲液的作用是抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响()(4)电泳过程中蛋白质的运动速率只与带电性质有关()(5)一般用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来测定蛋白质的纯度()探究主体 1 蛋白质的分离技术问题情境 1.下图为利用凝胶色谱法分离蛋白质的图示，讨论：(1)说出凝胶色谱法分离蛋白质的原理。提示：相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，只能在凝胶外部移动，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。(2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱
8、柱中洗脱出来？提示：相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？提示：不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。2如图表示对某蛋白质溶液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，讨论：(1)蛋白质在电场中怎样移动？提示：蛋白质上某
9、些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动。(2)蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少吗？为什么？提示：不是，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移动速度与本身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。(3)电泳结果表明溶液中的蛋白质可能有多少种？提示：SDS可使蛋白质变性形成肽链，故结果所示可能是一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。凝胶色谱法与电泳法的比较内容凝胶色谱法电泳法分离依据分子相对分子质量大小分子带电性质差异、分子大小和形状等分离动力重力电场力分子大小的影响分
10、子大，移动速度快分子大，阻力大，移动速度慢易错警示琼脂糖凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别(1)分离原理不同琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。(2)用途不同琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。1凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是()A相对分子质量较小的蛋白质B相对分子质量较大的蛋白质C凝胶颗粒D葡萄糖或琼脂糖分子解析：凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质
11、量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。答案：B2有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是()A它们都是分离蛋白质的重要方法B它们的原理相同C使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D以上说法都正确解析：不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以A正确，B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C
12、错误。答案：A探究主体2 凝胶色谱操作的分析1凝胶色谱柱的制作(1)取长40 cm，内径为1.6 cm的_，两端需用砂纸磨平。(2)柱底部制作：选择适合的橡皮塞橡皮塞打孔挖出_安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将_上部包好。(3)柱顶部制作：打孔安装玻璃管。(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。提示：(1)玻璃管(2)凹穴 橡皮塞2凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量(2)凝胶_：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液(3)_：将色谱柱垂直固定在支架上(4)_：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内(5)_：用 20 mmo1/L 的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤
13、平衡凝胶 12 h，使凝胶装填紧密提示：(2)溶胀(3)固定(4)装填(5)洗涤平衡3样品的加入和洗脱(1)打开流出口，使缓冲液与凝胶面_，关闭出口(2)用吸管将_样品加到色谱柱顶端，打开出口，使样品进入凝胶层后，关闭出口(3)小心加入物质的量浓度为_到适当高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱(4)待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每_收集一管，连续收集提示：(1)平齐(2)1 mL(3)20 mmol/L的磷酸缓冲液(4)红色的蛋白质 5 mL1红细胞的洗涤(1)离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。(2)重复洗涤三次
14、，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。2色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需12 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。3凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。(1)在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(2)在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。4蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带
15、的移动状况判断收集流出液的时间。1下列关于血红蛋白提取和分离实验的描述，正确的是()A红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离D透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h解析：红细胞洗涤过程中应该用生理盐水，不能用蒸馏水，A错误；血红蛋白的释放应该加入蒸馏水和甲苯，使红细胞吸水涨破，释放其中的血红蛋白，B错误；将搅拌好的混合液通过离心、过滤后，用分液漏斗分离出血红蛋白溶液，C正确；透析所用的磷酸缓冲液的pH为7.0，D错误。答案
16、：C2下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。(2)甲装置用于_，目的是去除样品中_的杂质，图中A是_。B是_溶液。(3)用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。(4)乙装置中，C是_，其作用是_。(5)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管和试管中蛋白质含量最高，则试管中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白_(填“大”或“小”)。解析：(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有
17、运输功能。(2)甲装置为透析装置，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。其中A是磷酸缓冲液，B是血红蛋白溶液。(3)乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。(4)乙装置中，C溶液为磷酸缓冲液，作用是洗脱血红蛋白。(5)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。最先收集到的蛋白质是血红蛋白分子，则试管内的大量蛋白质为血红蛋白。由于试管晚于试管收集得到，因此其内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢，其相对分子质量比血红蛋白小。答案：(1)运输(2)透析(粗分离)相对分子质量较小 磷酸缓冲液 血红蛋白(3)凝胶
18、色谱法 相对分子质量的大小(4)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白(5)红色的蛋白质接近色谱柱底端 小方法技巧凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法(1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱底端时，就要收集流出液。(2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂，以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。夯实生命观念1透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。2利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。3在电泳中，待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完
19、全取决于分子的大小。5蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。6在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。注重语言表达1教材P70“旁栏思考题”：你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？提示：如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。2怎样分析血红蛋白的分离是否成功？提示：如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离
20、的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。1利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是()A蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B蛋白质相对分子质量的大小C蛋白质所带电荷的多少D蛋白质溶解度的大小解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。答案：B2下列有关电泳的叙述，不正确的是()A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度C进行电泳时，带电
21、粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动D常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳解析：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确，C错误；由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，会使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，B正确；琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常见的电泳方法，D正确。答案：C3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入的SDS的作用是()A增大蛋白质的相对分子质量B将蛋白质分解成单个氨基酸C掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别D增加不同蛋白质分子间的电荷差别解析
22、：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的目的是使蛋白质完全变性，解聚成单条肽链；同时SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，所以C正确。答案：C4在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是()A防止血红蛋白被氧气氧化B血红蛋白是一种碱性物质，需磷酸中和C磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能不变解析：磷酸缓冲液的作用是稳定pH，从而维持血红蛋白的结构和功能不变。答案：D5对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_、_、_
23、和纯度鉴定。(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是_。(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、_和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到_(填仪器)分出下层的红色透明液体。(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。透析的目的是_；透析的原理是_。(5)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化。样品纯化的目的是_；血 红 蛋 白 的 特 点 是 _，这 一 特 点 对 分 离 血 红 蛋 白 的 意 义 是_。解析：(1)蛋白质的提取和分离一般分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四个步骤。(2)柠檬酸钠有抗凝血的作用，在采血
24、容器中加入柠檬酸钠可以防止采集的血液凝固。(3)血红蛋白分离和提取中，样品处理又可细分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放和分离血红蛋白溶液，其中分离血红蛋白溶液时用到分液漏斗。(4)透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内，所以透析可以除去分子量较小的杂质。(5)样品纯化的目的是将相对分子质量大的杂蛋白除去。血红蛋白呈现红色，在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时期，使血红蛋白的分离过程更直观，大大简化了实验操作。答案：(1)样品处理 粗分离 纯化(2)防止血液凝固(3)血红蛋白的释放 分液漏斗(4)去除样品中分子量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内(5)将相对分子质量大的杂蛋白除去 呈现红色 在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作04 课后 巩固提升