1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数学 习 目 标知 识 体 系1.分析培养基对微生物的分离作用。2.进行土壤中微生物的分离、计数和鉴定。(重点、难点)01 探新知 自主梳理02 破重难 讲练互动03 固双基 当堂达标04 课后 巩固提升一、筛选菌株的思路及计数1筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时其他微生物的生长。(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。目的菌株抑制或阻止特定抑制或阻止2统计菌落数目(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。原理：当样品的足够高时，培养基
2、表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M。C：代表某一稀释度下平板上生长的。V：代表涂布平板时所用的稀释液的(mL)。M：代表。统计方法：为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在的平板进行计数，并取其。(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。稀释度活菌菌落数平均菌落数体积稀释倍数30300平均值3设置对照(1)对照实验：指除了的条件外，其他条件都相同的实验。(2)主要目的：排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。被测试非测试因素二、实验设计1土壤取样(1)
3、取样原因：土壤有“”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。(2)土壤要求：富含有机质，pH接近且潮湿。(3)取样部位：距地表约的土壤层。2样品稀释(1)稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得的菌落数在之间，便于计数。微生物的天然培养基中性38 cm30300(3)稀释倍数测定土壤中的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养。测定放线菌的数量，一般选用倍稀释。测定真菌的数量，一般选用倍稀释。细菌103、104和105102、103和1043微生物的培养与观察(1)培养：不同种类的
4、微生物，往往需要不同的培养和培养。(2)观察：每隔统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。4细菌的计数：当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个平板进行计数，求出，并根据所对应的计算出样品中细菌的数目。温度时间24 h平均值稀释度三、操作提示1无菌操作(1)取土样的用具在使用前都需要。(2)实验操作均应在进行。2做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的、以及平板上培养样品的等。3制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高。4菌种鉴定(1)方法：在以为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。灭菌火焰旁种类培养日期稀释度工作
5、效率尿素(2)原理预习小测1想一想怎样选择可用于计数的平板？提示：选择菌落数在30300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。2判一判(1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为固体培养基()(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数()(3)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计()(4)利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数()(5)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量()(6)培养分解尿素的细菌，培养基的pH值会增大()探究主体 1 分解尿素的细菌的分离与鉴定问题情境 下面是
6、筛选分解尿素的细菌的培养基的配方，请分析：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL(1)从物理性质看，该培养基属于_培养基，从功能上看属于_培养基。提示：固体 选择(2)该培养基是如何实现对分解尿素的细菌的筛选的？提示：该培养基中唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能够分解尿素，而不能合成脲酶的微生物不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用该培养基能够筛选出分解尿素的细菌。(3)如何证明该选择培养基的确起到了筛选作用？提示：同时设置牛肉膏蛋白胨培养基并进
7、行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目；若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则证明了选择培养基的确起到了筛选作用。(4)如何证明所用的选择培养基没有受到环境污染？提示：将未接种的上述培养基与接种的上述培养基同时培养，观察是否有菌落的产生；若未接种的培养基无菌落产生，则证明培养基没有受到环境污染。1三种筛选目的菌株的方法方法特点举例利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长缺乏氮源的培养基可筛选固氮微生物利用某种化学物质进行的选择培养在培养基中加入某种化学物质，抑制某些微生物，同时选择所需的微生物加入青霉素的培养基可抑
8、制细菌，分离出真菌利用培养条件进行的选择培养改变微生物的培养条件将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物2.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用微生物筛选过程中，除选择培养基外，另外还需设置两组对照培养基，以提高实验的说服力和科学性。对照组作用现象结论未接种培养基有无杂菌污染的判断未接种的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染接种的全营养培养基选择培养基有无筛选作用的判断全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用易错警示能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物
9、可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此，能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。1在分解尿素的细菌的分离和鉴定中，对先后用到的两种培养基，叙述正确的是()A加入酚红指示剂作为选择培养基，再加入唯一碳源作为鉴别培养基B加入唯一氮源作为鉴别培养基，再加入酚红指示剂作为选择培养基C加入唯一氮源作为选择培养基，再加入酚红指示剂作为鉴别培养基D加入酚红指示剂作为选择培养基，再加入唯一碳源作为鉴别培养基解析：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌；细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
10、培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。答案：C2某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_。能 分 解 尿 素 的 细 菌 不 能 以 尿 素 的 分 解 产 物 CO2 作 为 碳 源，原 因 是_，但 可 用 葡 萄 糖 作 为 碳 源，进 入 细 菌 体 内 的 葡 萄 糖 的 主 要 作 用 是_(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_。(3)用来筛选分解尿素细菌
11、的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_(答出两点即可)。解析：(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。(3)用来筛选分解尿
12、素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有：KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液，可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐。答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定方法技巧选择培养基的常见类型(1)分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。(2)
13、常见的选择培养基加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培养基可以分离固氮微生物。以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。将培养基放在高温环境中培养，可以分离耐高温的微生物。探究主体 2 微生物数量的统计问题情境 下面是土壤中微生物的分离与计数的实验流程示意图。分析回答：(1)图示统计菌落数目的方法是_，利用该法统计的菌落数往往比活菌的实际数目_，原因是_。提示：稀释涂布平板法 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落(2)分离不同的微生物要采用不同的稀释度，原因是_；稀释操作成功的标准是_。提示：土壤中各种微生物的数量
14、是不同的 得到2个或2个以上菌落数在30300的平板(3)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？提示：不真实。为增强实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？提示：不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验结果不一致的情况，应分析实验过程中
15、可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃。(4)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下数据，试计算1 g样品的活菌数。平板稀释度 平板1平板2平板3104菌落数太多，难以计数菌落数太多，难以计数菌落数太多，难以计数105212234287106212318提示：105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板的菌落数在30300，计算其平均值为(212234287)/3244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(2440.1)1052.44108。1测定微生物数量的方法的比较测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法(活菌计数法)和显微镜直接
16、计数法。二者的比较如下：项目显微镜直接计数法稀释涂布平板法(间接计数法)原理利用特定的血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌项目显微镜直接计数法稀释涂布平板法(间接计数法)主要用具显微镜、血细胞计数板培养基计数依据菌体本身培养基上的菌落优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低(当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落)计算公式每毫升原液所含细菌数40010 000
17、每小格平均菌体数稀释倍数每毫升原液所含细菌数某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积稀释倍数注：表中400和10 000都是常数。2实验结果分析内容现象结论样品的稀释操作得到3个或3个以上菌落数目在30300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近易错警示分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀
18、释液。(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验悬殊过大的，需要对该平板重新制作。1用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A涂布了一个平板，统计的菌落数是230B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是209、240和250，取平均值233解析：在设计实验时，一
19、定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能将3个平板的计数值用来求平均值。答案：D2如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验示意图。据图分析下列叙述正确的是()A3号试管中样品的稀释倍数为103倍B用4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数约为5号试管的10倍C5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7108个D该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高解析：将10 g土样加入90 mL无菌水中后，土样稀释10倍，再经3次1
20、0倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中样品的稀释倍数是104倍，A错误；4号试管中稀释液进行平板培养，其稀释倍数为5号试管的10倍，如果稀释倍数适当，操作等正确，其得到的菌落平均数可能是5号的10倍，B正确；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明，每克土壤中的菌株数为(168175167)30.11061.7109(个)，C错误；稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌长成一个菌落的情况，因此该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。答案：B方法技巧用稀释涂布平板法计数微生物的方法(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
21、(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。夯实生命观念1测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。2稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌数目低。3只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的选择培养基分离该细菌。4鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。注重语言表达1怎样评价选择培养基是否筛选出菌落。提示：牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基
22、已筛选出一些菌落。2怎样判断样品的稀释操作是否成功？提示：如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3教材P22“旁栏思考题”：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后根据公式(CV)M进行计算。1下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是()AKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水BKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、琼脂、水CKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、尿素、琼脂、水
23、DKH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水解析：分离获得分解尿素的细菌应采用选择培养基，要求培养基中唯一的氮源为尿素，同时还要含有碳源、水、无机盐，A正确。答案：A2下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448 hD确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数解析：检测细菌总数，用蒸馏水配制培养基，常用高压蒸汽灭菌法灭菌后，取104、1
24、05、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组放置在适宜条件下培养，在确定对照组无菌后，选择菌落在30300的平板为代表进行计数，D错误；A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法。答案：D3关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中，下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的一组是()土壤取样 称取土壤 稀释土壤溶液 涂布平板 微生物的培养A BCD解析：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验需进行无菌操作，其中土壤取样是在室外进行，微生物的培养是在恒温箱中进行，其余过程都需要在酒精灯火焰旁进行，D项正确。答案：D4“土壤中分解尿素的细菌的
25、分离与计数”实验中以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是()从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解氨的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌统计所取土壤样品中究竟有多少分解尿素的细菌ABCD解析：从土壤中分离出分解尿素的细菌并对其计数，统计的是每克土壤样品中含多少分解尿素的细菌，用公式“每克样品中菌株数(C/V)M”进行推测。其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。答案：A5将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
26、回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110
27、、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有 人 认 为 这 两 位 同 学 的 结 果 中，乙 同 学 的 结 果 可 信 度 低，其 原 因 是_。解析：(1)M培养基若用于真菌的筛选，说明M培养基能满足真菌的生长，而能抑制其他微生物的生长，链霉素是一种抗生素，可以抑制细菌的生长。加入了链霉素的培养基能筛选出真菌，该培养基属于选择培养基。(2)微生物生长需要多种营养物质除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。氮元素是蛋白质和核酸等生物大分子的组成元素，因此氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有蛋白质和核酸。(3)淀粉与碘液会变成蓝色，筛选产淀粉酶的微生物，依据淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，再根据透明圈，来筛选产淀粉酶的微生物。(4)乙同学结果不合理，因为1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差，不能简单地用其平均数作为最终结果。答案：(1)细菌 选择(2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸(3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差04 课后 巩固提升