1、第二节分子生物学技术1简述PCR技术的原理及基本操作步骤。(重难点)2尝试进行DNA片断的PCR扩增。(难点)P C R 扩 增 的 原 理 和 过 程1细胞内DNA复制的条件原料4种脱氧核苷酸模板2条DNA母链酶解旋酶和DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸2.PCR扩增技术(1)概念：在体外快速扩增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的实验技术，又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。(2)PCR技术的原理：条件：DNA模板、TaqDNA聚合酶、脱氧核苷酸引物、四种脱氧核苷酸。PCR扩增的特点：快速、简便和灵敏。进行PCR的先决条件：待扩增的DNA片段3端的脱氧
2、核苷酸序列要为已知。引物序列确定的依据是：被扩增区域的3端边界DNA序列。3PCR反应的过程变性退火(复性)延伸合作探讨探讨1：什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。探讨2：为什么PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶？提示：因为PCR反应过程中变性和延伸都需要较高的温度，一般的DNA聚合酶在这种温度下会变性失活，只有耐高温的TaqDNA聚合酶在这种温度下可以正常发挥作用。探讨3：如果某DNA片段经过PCR反
3、应扩增了4个循环，请计算双链中都含引物的DNA分子的数目。提示：由于DNA复制具有半保留复制的特点，所以含有母链的DNA分子只有两个，其他分子的两条链都含有引物。复制4次共形成2416(个)，有14个DNA分子的两条链均含引物。思维升华1PCR解旋与复旋的原理：DNA热变性的原理2PCR的反应过程(1)变性：当系统温度上升到90 以上时，双链间的氢键打开，DNA解旋为单链，如图：(2)复性：当系统温度下降到50 左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合，如图：(3)延伸：当系统温度上升到72 左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A，G，C，T)在DNA聚合酶的作用下，从引物的3末端
4、开始，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图：3PCR扩增的计算理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N02n个。1下列有关PCR的描述，不正确的是()APCR的技术原理是DNA复制B是一种酶促反应，需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶C一个DNA片断经PCR扩增，可形成2n个DNA片断(n代表循环的次数)DPCR技术利用DNA的热变性来控制DNA的解聚与结合【解析】PCR技术是利用热变性原理让模板DNA分子解旋的而不是通过解旋酶的作用。【答案】B2PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量
5、太低而难以对样品进行研究的问题，从而被广泛应用，此过程需要TaqDNA聚合酶。请回答有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用_。(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。为什么在热泉中只筛选出来Taq细菌呢？_。TaqDNA聚合酶的功能是_。TaqDNA聚合酶的化学本质为蛋白质，可用_法和_法进行分离。(3)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在_中才能进行，并且要严格控制_条件。(4)PCR中加入的引物有_种，加入引物的作用是_。【解析】(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋。(2)利用细菌特有的特性而与其他细菌区分开来
6、，Taq细菌具有耐高温的特性，放在高温环境下，其他绝大多数细菌死亡，而Taq细菌得以保留。在DNA分子复制中，TaqDNA聚合酶将一个脱氧核苷酸的脱氧核糖和另一脱氧核苷酸的磷酸连接形成磷酸二酯键。蛋白质的分离可以根据其分子大小和带电的性质和多少使之分离，即凝胶色谱法和电泳法。(3)PCR反应是在一定的缓冲溶液中进行的，并需严格控制好温度条件。(4)PCR与体内DNA复制过程中的原料是完全相同的，并加入小段单链DNA或RNA作为引物，引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。【答案】(1)高温使DNA分子热变性(2)热泉70 80 的高温条件淘汰了绝大多
7、数微生物催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键凝胶色谱电泳(3)一定的缓冲溶液温度(4)2作为DNA复制的起点目 的 D N A 片 段 的 体 外 扩 增1DNA片段的PCR扩增(1)准备器材(2)在0.2 mL PCR薄壁离心管中加入5_L10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 L,1_L模板DNA，5_L引物1和5_L引物2,29_L双蒸水。(3)煮沸5_min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/L加入Taq聚合酶。(4)扩增DNA片断的反应程序：将离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94_的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94 ，30 s55 ，30 s72 ，1
8、 min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72_，1_min。运行反应程序。2DNA分子的测定合作探讨探讨1：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？提示：在PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水都要在使用前进行高压灭菌。探讨2：为什么要将微量离心管放在离心机上进行离心？提示：离心的目的是使反应液集中在离心管底部。探讨3：PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶、引物等条件，如何通过设置对照实验进行验证？提示：在对照组中不加入TaqDNA聚合酶或引物，与实验组形成对照，就可以证明PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶和引物。思维升华1PCR实验操作的注意事项(1)PCR所用的缓冲
9、液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。(2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。(5) PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。2PCR技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。(2)对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进
10、一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。(5)在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。1下列操作过程的叙述中错误的是()APCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换【解析】为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中所用的微量离
11、心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等，在使用前要进行高压灭菌；还要将所用的缓冲液和酶分装成小份；并且使用一次性吸液枪头，则A、B、D项都正确。在使用前，将PCR所需试剂从冰箱内拿出来，放在冰块上缓慢融化，则C项错误。【答案】C2PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是() 【导学号：67850055】94 ，使DNA分子变性，失去生物活性94 ，使DNA分子变性，解开螺旋56 ，使DNA分子开始复制、延伸56 ，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性72 ，使DNA分子开始复制、延伸72 ，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性ABC D【解析】PCR利用了DNA的热变性原理，通过控
12、制温度来控制双链的解旋与结合，PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。当温度上升至94 时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；温度下降到50 左右(56 )，引物与DNA单链结合，DNA恢复双螺旋结构，恢复活性；温度上升至72 ，DNA分子开始复制延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。【答案】C3有关PCR技术，下列叙述不正确的是()A多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术B在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似CPCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸DPCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性、延伸【解析】P
13、CR是多聚酶链式反应的英文缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板(母链)、酶、原料、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。【答案】C1PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上是一种能自动调节温度的仪器。下列关于PCR过程中温度控制的说法，错误的是 ()A酶促反应需要高温，是为了保证模板是单链B延伸的温度必须高于退火的温度，而低于变性的温度C要用耐高温的DNA聚合酶D需要耐高温的解旋酶【解析】PCR是体外DNA扩增技术，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性
14、。【答案】D2右图为DNA变性和退火示意图，下列相关说法正确的是() 【导学号：67850056】A向右的过程为加热(94 )变性的过程B向左的过程是DNA双链迅速制冷退火C变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同D图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3端【解析】变性后的DNA在缓慢降温后才会退火；变性与在生物体内解旋过程的条件不同，实质相同；任一DNA片段都有2个游离的磷酸基(5端)和2个3端。【答案】A3PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链做模板时将()A仍与引物结合进行DNA子链的延伸B与引物结合进行DNA子
15、链的延伸C同时与引物和引物结合进行子链延伸D无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链【解析】当由引物延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物结合延伸DNA子链。【答案】B4近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开_键，称为_。(2)当温度降低时，引物与模板_端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸
16、，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是_，遵循的原则是_。(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度由_自动调控，酸碱度则靠_来维持。(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是()A可加快DNA的复制速度B引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C引物的5端有助于DNA聚合酶延伸DNA链DDNA聚合酶只能从3端延伸DNA链【解析】(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷
17、酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的3端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。(3)PCR技术除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度靠PCR仪自动调控，而酸碱度靠缓冲液来维持。(4)引物的作用是结合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位点，而DNA聚合酶的作用是从引物的3端开始催化DNA链的延伸，故选D。【答案】(1)氢变性(2)3四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则(3)PCR仪缓冲液(4)D课堂小结：网络构建核心回扣1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。2.PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。3.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。4.PCR每次循环都包括变性、退火(复性)和延伸三步。5.PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。6.测定DNA分子的试剂是二苯胺。DNA在酸性条件和加热下，能与二苯胺试剂生成蓝色的物质。