1、第一节生物成分的分离与测定技术1掌握分离与测定生物成分中蛋白质的技术。(难点)2掌握采用醋酸纤维薄膜电泳的方法分离并纯化蛋白质。(重点)3掌握采用水蒸气蒸馏法和脂溶性有机溶剂提取法提取脂肪成分。(重难点)分 离 与 测 定 生 物 成 分 中 的 蛋 白 质1抽提液的选择2分离蛋白质的方法(1)离心沉降法：通过控制离心速率，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。(2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与小分子化合物分离开的纯化蛋白质的方法。(3)凝胶色谱法：概念：根据蛋白质分子的大小对其进行有效分离的方法。凝胶原理是否进入凝胶颗粒移动途径路程移动速度洗脱次序大分子蛋白
2、质不能进入凝胶颗粒间隙较短较快先洗脱出来小分子蛋白质可以进入凝胶颗粒内部较长较慢后洗脱出来(4)电泳法：将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来。3血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳配制试剂准备器材架滤纸桥浸泡薄膜细心点样平悬薄膜实施电泳染色漂洗脱色探讨1：在抽提液中加入蛋白酶抑制剂的目的是什么？提示：防止提取过程中蛋白质被蛋白酶分解。探讨2：在电泳过程中，影响泳动速度的因素有哪些？提示：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。探讨3：洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗
3、净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白质与杂质血浆蛋白混在一起加大了分离的难度。1蛋白质的分离方法(1)薄膜透析法：原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖、氨基酸等。常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。(2)离心沉降法：原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此分离。(3)电泳：概念：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。原理：不同的物质所带电荷不同，颗
4、粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速度不同。影响泳动速度的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。泳动规律：带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。常用方法：支持物电泳。支持物：滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。2血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳(1)特点：电泳后区带界限清晰。通电时间较短(6090 min)。它对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象。对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。(2)关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前，应将薄膜表面
5、多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分离效果。(3)结果及其分析：结果：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱示意图结果分析：从电泳图谱示意图中可以看出：a血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：球蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白。b由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带负电荷，四种球蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白。3凝胶色谱法分离血红蛋白(1)样品处理：以低速短时间离心分离红细胞，获得被洗净的红细胞。(2)血红蛋白的释放、分离和透析：用蒸馏水和甲苯破裂红细胞，释放出血红蛋白，得到混合液。
6、离心混合液，过滤除去沉淀层，用分液漏斗分离出红色透明液体。用磷酸缓冲液透析红色透明液体12 h。(3)凝胶的制备：用蒸馏水溶胀交联葡萄糖凝胶，制成凝胶悬浮液。(4)色谱柱的装填：垂直固定洗净的层析柱选择有薄膜的端为下口。打开下端的乳胶管开口，将搅动均匀的凝胶悬浮液沿柱的内壁缓缓一次性倒入柱内。连接洗脱瓶，用洗脱液充分洗涤平衡凝胶12 h。(5)样品的加入：打开流出口，让缓冲液下降到刚好与凝胶面平行，关闭出口。用滴管将样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱顶端。打开流出口，使样品液逐渐渗入到凝胶。(6)洗脱与收集：连接好层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1 mL，进行洗脱。当红色的蛋白质接近出口时，收集
7、洗脱液。1下列关于蛋白质的纯化方法的叙述，错误的是()A纯化主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的B透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同C通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质D不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质【解析】透析法分离纯化蛋白质是因为蛋白质的分子大，不能透过半透膜。【答案】B2下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是() 【导学号：67850051】A架滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上B浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号C平悬薄
8、膜时，有记号的一面朝上D从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色【解析】薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白质区底色脱净为止，然后才用透明液脱色。【答案】D3下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是()A可采集猪血作为实验材料B用蒸馏水重复洗涤红细胞C血红蛋白释放后应低速短时间离心D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液【解析】血红蛋白存在于红细胞中，而哺乳动物的成熟红细胞中无核、无细胞器，因此细胞中的干扰物质相应较少；洗涤红细胞时，应用生理盐水；血红蛋白释放后，采用的离心速度为2 000 r/min，时间是10 min；红色的蛋白质接近色谱柱出口时，开始收集洗
9、脱液。【答案】A从 生 物 材 料 中 提 取 芳 香 油1提取方法主要有蒸馏法、压榨法和萃取法等，具体采用的方法要根据植物材料的特点来决定。(1)对玫瑰油、薄荷油等挥发性较强，能随水蒸气蒸发的植物芳香油通常利用蒸馏法提取。(2)柠檬油、甜橙油易受机械压力作用而直接榨出，一般采用压榨法制得。(3)如橘皮芳香油既可采用蒸馏法提取，也可采用压榨法制得。(4)如制取茉莉浸膏还可采用萃取法制取。2蒸馏(1)概念：将液体加热至沸腾，使液体变为蒸气 ，然后使蒸气冷却再凝结为液体，这两个过程的联合操作称为蒸馏，是分离和提纯液态混合物常用的方法之一。(2)分离的种类：易挥发和不易挥发的物质。液体混合物中沸点不
10、同的物质。3水蒸气蒸馏法提取橘皮中的芳香油探讨1：橘皮芳香油的主要成分是什么？有哪些主要用途？提示：主要成分是柠檬烯。主要用于生产食用香精、化妆品香精和医药香精。探讨2：适合用水蒸气蒸馏法提取的成分应具有怎样的特性？提示：适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸发而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。探讨3：在水蒸气蒸馏橘皮中的芳香油时，冷凝管的出水门为什么安装在进水口的上端？提示：目的是为了使产生的蒸气充分冷却。1提取方法基本方法有三种：蒸馏法、压榨法和萃取法。具体采用哪种方法要根据植物原料的特点来决定。最常用的方法水蒸气蒸馏法(1)原理：水和芳香油的沸点不同，利用水蒸气将挥发性
11、较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，再冷却分离。(2)分类：根据蒸馏过程中原料放置的位置，可以将水蒸气蒸馏法划分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。(3)适用范围：适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸点多在100 以上，并在100 左右有一定的蒸气压。中药的挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏。2水蒸气蒸馏装置的安装(1)正确安装蒸馏装置固定热源酒精灯。固定蒸馏瓶，保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。连接冷凝管，保证上
12、端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。连接接液管(或称尾接管)。将接收瓶瓶口对准接液管的出口。将温度计固定在蒸馏瓶瓶口处，使温度计水银球的上限与蒸馏瓶侧管的下限处在同一水平面上。水蒸气、蒸馏装置(2)实验操作流程(3)实验注意事项安装装置顺序：从左到右，自下而上。拆卸仪器时与安装时相反。烧瓶中的液体量：烧瓶容积的。加热时防暴沸：垫石棉网，向液体中加入几片碎石或瓷片。温度计位置：温度计的水银球应与蒸馏烧瓶的支管口下沿保持水平。冷凝管中水流方向：从下方进水，上方出水，与蒸气流向相反。装置安装好后，应先在冷凝管中通水再加热。除水：加入无水Na2SO4后，放置时间
13、可适当长些。温度及时间：为提高产品质量，要严格控制蒸馏温度，可适当延长蒸馏时间。1下列属于植物芳香油理化性质的是()具有较强的挥发性易溶于水易溶于有机溶剂具有特殊的植物香味ABC D【解析】植物芳香油是植物有效成分的提取液，其特点是有特殊的植物香味和较强的挥发性，且不易溶于水，易溶于有机溶剂。【答案】C2如图是用水蒸气蒸馏法从薄荷叶中提取薄荷油的装置图，请据图补充完整下面的实验并回答有关问题：水蒸气蒸馏装置.实验步骤：(1)安装好如图所示的装置，特别要注意将冷凝器夹好。(2)将薄荷叶尽量剪碎，取适量的薄荷叶放入_瓶内。(3)向_瓶内加水，至容积的_左右，为防止出现水碱，可加入数滴稀硫酸，还应向
14、瓶中放入几粒_以防暴沸。(4)向冷凝器中通入_。(5)放好连接管，将连接管的出口放在接收瓶中。接收瓶口上盖一小块铝箔或牛皮纸。(6)将蒸气发生器加热，至瓶中的水沸腾，然后调节火的大小，以维持水稳定的沸腾温度。(7)当接收瓶内漂在水上的油状物(即精油)不再增多时即可停止实验。.回答有关问题：(1)A蒸馏瓶通入B蒸馏瓶中的连接管为什么插入B蒸馏瓶底部？_。(2)冷凝器的作用是_。(3)接收瓶口上盖一小块铝箔或牛皮纸，其目的是_。【解析】水蒸气蒸馏法的原理是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物又会重新分出油层和水层。用水蒸气蒸馏法提取芳香油时，原料放入B瓶中，通入
15、水蒸气的玻璃管到达瓶底，让水蒸气自下而上进行蒸馏。A瓶中水量不能加满，约占2/3就行，为防止水暴沸，可向A瓶内放入几粒沸石或碎玻璃、碎砖瓦等。薄荷油具有挥发性，因此在接收瓶口上盖一小块铝箔或牛皮纸。【答案】.(2)B(3)A2/3沸石或碎玻璃、碎砖瓦(4)自来水.(1)让水蒸气自下而上进行蒸馏(2)使混合气体冷凝(3)薄荷油具有挥发性，以减少薄荷油的散失1用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快【解析】凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的
16、蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。【答案】D2蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是() 【导学号：67850052】A根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离B根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳法分离蛋白质C根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质D根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质【解析】蛋白质分子是生物大分子，都不能通过半透膜，因此不能利用半透膜分离蛋白质；蛋白质分子
17、所带电荷性质的差异及分子大小可以使蛋白质分子在电场中获得不同的迁移速度，因此可以利用电泳法分离蛋白质；蛋白质相对分子质量的大小不同，通过凝胶柱的时间不同，可通过凝胶色谱法分离蛋白质；蛋白质的分子大小、密度不同，具有不同的离心力，可通过离心沉降法分离蛋白质。【答案】A3下列关于植物芳香油的说法，错误的是()A可溶于水，所以可以用蒸馏法提取B具有较强的挥发性，能随水蒸气一起蒸发C提取方法主要有蒸馏法、压榨法和萃取法D蒸馏时，流入收集瓶中的乳浊液分层，上层为芳香油，下层为水【解析】植物芳香油为脂溶性物质，不溶于水，而易溶于有机溶剂。【答案】A4凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，对高分子物质有
18、很好的分离效果，目前已经被多个领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答下列问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。【解析】(1)用凝胶色谱技术分离各种不同蛋白质时，大分子物质由于直径较大，只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒
19、的微孔，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒内，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，所以大分子物质先洗脱出来。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由尼龙网和尼龙纱替代。(3)在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干、露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。(4)洗脱液应与浸泡凝胶所用液体相同，且洗脱液流速要稳定，以免干扰洗脱结果。
20、【答案】(1)aa相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶间隙移动，路程较短，移动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)相同保持稳定课堂小结：网络构建核心回扣1.分离与测定生物成分中蛋白质的技术包括离心沉降法、薄膜透析法、凝胶色谱法和电泳法等。2.离心沉降法是通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而分离出不同种类的蛋白质。3.凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。4.在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。5.薄膜透析法是利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离开的纯化蛋白质的方法。6.提取植物芳香油的方法有蒸馏法、压榨法和萃取法等。