1、12 基因工程的基本操作程序学习导航1.掌握目的基因获取的常见方法。难点2.学会基因表达载体构建的方法和要求。重点3.理解目的基因导入受体细胞的具体过程。4.掌握目的基因检测与鉴定的具体操作。要点新知初探思维启动 一、目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物的不同_的DNA片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。基因基因文库包括两种：_文库，即包含一种生物所有基因的文库；_文库,即只包含一种生物的一部分基因的文库，如cDNA文库。2.利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR的含义：是一项在生物_复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)目
2、的：短时间内大量扩增目的基因。(3)原理：_。基因组部分基因体外DNA双链复制(4)过程：第一步：加热至9095,_;第二步：冷却至_，引物与两条单链DNA相应互补序列结合；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。(5)特点：指数形式扩增。DNA解链为单链5560想一想 1PCR过程中，需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？【提示】PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。3.用化学方法人工合成 如果基因比较_,核苷酸序列又已知,也可以通过DNA合成
3、仪用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建 基因表达载体的组成：必须有启动子、_、终止子以及标记基因等。小目的基因三、将目的基因导入受体细胞 1.转化 _进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。2.常用的导入方法(1)将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是_转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法。目的基因农杆菌(2)将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是_技术。此方法的受体细胞多是_。(3)将目的基因导入微生物细胞的方法：用_处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生物状态,这种细胞称为_细胞。将重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合，在一定温度下完成转
4、化过程。显微注射受精卵Ca2感受态想一想 2从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？【提示】不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。四、目的基因的检测与鉴定 1.首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了_,方法是采用_技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出了_,方法是采用_技术。目的基因DNA分子杂交mRNA分子杂交3.最后检测目的基因是否翻译成_,从分子水平检测的方法是采用_技术。4.有时还需进行_水平的鉴定。如需要做抗虫或抗病的接种实验等。蛋白质抗原抗体杂交个体
5、生物学要点突破讲练互动 要点一“目的基因的获取”应注意的几个问题 1.PCR技术与DNA复制的比较比较项目 DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋 场所 细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪中)比较项目 DNA复制 PCR技术 区别 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶 耐热的DNA聚合酶 温度 细胞内温和条件 控制温度，需9095高温 结果 合成DNA分子 合成DNA片段或基因 联系(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸 2
6、.人工合成目的基因常用方法 人工合成目的基因的方法主要有两种。(1)反转录法，主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，其过程如下：(2)化学合成法，即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：(2012青岛市高二期末)1970年，科学家证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：例1(1)催化过程的酶是_；核酸酶H的作用是_。(2)过
7、程也称为DNA的变性，此过程在温度高达9095 时才能完成，说明DNA分子具有_性。(3)由图中信息分析可知，催化过程的酶都是_，两者在作用特性上的区别是_。(4)如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶_个。【解析】根据图示可以看出，该过程是RNA在逆转录酶的催化作用下形成cDNA(负链DNA)，构成RNADNA中间体。中间体中的RNA再经过RNA酶H水解，而以剩下的负链DNA复制成双链DNA。过程是由RNA合成DNA的过程，需要逆转录酶进行催化。过程是以单链DNA复制获得双链DNA的过程需要DNA聚合酶催化。属于双链DNA复
8、制的过程，需要DNA聚合酶催化。过程在7075 环境下进行，所需要的酶能够耐高温。【答案】(1)反转录酶(或逆转录酶)分解RNA(2)稳定(3)DNA聚合酶 催化过程的酶耐高温(4)60互动探究(1)上述过程中需要限制酶和DNA连接酶吗？(2)由mRNA逆转录形成的DNA具有启动子吗?【提示】(1)不需要。(2)无。【探规寻律】(1)PCR技术不需要解旋酶，但需利用9095 高温使DNA分子解旋。(2)PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。(3)PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶要点二 基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞
9、中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的构建(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录。(2)目的基因：编码相关蛋白质，形成基因工程产品或产生新的生物性状。(3)终止子：一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)。3.基因表达载体应具备的条件(1)对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生理活动；(2)能自我复制，能通过复制进行基因扩增；(3)具有
10、标记基因，以便于鉴定目的基因是否进入受体细胞；(4)重组DNA大小应适合，以方便操作。特别提醒(1)用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA分子的目的是产生相同的黏性末端，便于两者完成拼接。(2)终止子与终止密码子的区别 终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位是脱氧核苷酸；终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基，其组成单位是核糖核苷酸。(2012南师大附中高二检测)如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR、BamH的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因,P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的
11、基因的两端分别含有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。例2(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoR 酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_、_、_三种。若要从这些连接物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_。(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长 的 原 核 宿 主 细 胞 所 含 有 的 连 接 产 物 是_。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是_。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切时应选
12、用的酶是_。【答案】(1)目的基因载体连接物 载体载体连接物 目的基因目的基因连接物 分离纯化(2)载体载体连接物(3)启动子 mRNA(4)EcoR和BamH(只答一种酶不可)【误区警示】(1)切割质粒和目的基因的限制酶一般是同一种酶，以获得互补的末端，利于重组质粒的构建。(2)目的基因的首端和尾端需加上启动子和终止子。要点三 将目的基因导入受体细胞 不同受体细胞的常用导入方法受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 Ca2处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 转化过程 以农杆菌转化
13、法为例 将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达 将含有目的基因的表达载体提纯取受精卵显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物 Ca2处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子 特别提醒(1)完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(2)Ca2(或CaCl2溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。(3)目的基因能否在植株细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上(利用的原理是基因重组)。科学家通过基因工程的方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表
14、达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株抗虫棉。其过程大致如图所示，请分析回答：例3(1)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA是利用TDNA_的特点。(2)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为_。(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种,该题中涉及的是_。(4)目的基因能否在棉株内稳定遗传的关键是_。【解析】本题以抗虫棉的培育过程为背景,考查了运用基因工程技术生产转基因作物的步骤、方法。(1)Ti质粒的最大优点是能将目的基因导入到受体细胞的染色体DNA中，从而使目的基因在棉花体内稳定维持和表达。(2)目的基因进入受体细胞
15、内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(3)将目的基因导入植物细胞的方法很多，以农杆菌中的Ti质粒为目的基因载体的称为农杆菌转化法。(4)目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因。【答案】(1)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上(2)转化(3)农杆菌转化法(4)目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上【探规寻律】目的基因导入受体细胞的结果要点四 目的基因的检测与鉴定类型 步骤 目的 原理 过程 结果 分子水平检测 第一步 转基因生物染色体的DNA是否插入了目的基因 DNA分子杂交 含目的基因的DNA探针与转基因生物的基因组D
16、NA分子杂交 若有杂交带，说明插入成功 第二步 目的基因是否转录出mRNA 分子杂交 含目的基因的DNA探针与转基因生物的mRNA杂交 若有杂交带，说明转录成功 类型 步骤 目的 原理 过 程 结 果 分子水平检测 第三步 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原抗体杂交 提取蛋白质,与已知的相应抗体杂交 若有杂交带，表明翻译成功 个体水平鉴定 做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同(2011高考海南卷)回答有关基因工程的问题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若
17、要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_(相同、不同)黏性末端的限制酶。例4(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_，常用抗原抗体杂交技术。(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物
18、细胞的_上。【解析】(1)限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。(2)基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；检测是否形成蛋白质，使用抗原抗体杂交技术。(3)基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种,因此要把目的基因插入到染色体的DNA分子中。【答案】(1)平 相同(2)RNA聚合酶识别和结合的部位 Ca2 DNA分子杂交技术 蛋白质(3)TDNA 染色体DNA变式训练(2012广州六中高二检测)利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是()A棉花细胞中检测到载体上的标记基因 B山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的基因 C大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA D酵母菌细胞中提取到人的干扰素解析：选D。基因的表达即控制蛋白质的合成，包括转录和翻译，仅仅转录出mRNA还不能叫表达，只有合成了相应的蛋白质才能证明目的基因完成了在受体细胞中的表达。【易误警示】(1)目的基因检测与鉴定的三个步骤，都是在体外进行的。(2)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等标记含有目的基因的DNA片段。