1、第一节微生物的分离和培养1.培养基中含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子等营养物质。2培养基按化学组成可分为天然培养基和合成培养基，按物理性质可分为液体培养基和固体培养基。3配制固体培养基的过程为：配制培养基调节pH分装包扎灭菌搁置斜面。4消毒的目的是杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，灭菌则是杀死物体内外所有的微生物，包括孢子和芽孢。5接种的操作流程：准备接种接种环灭菌试管口灭菌挑取少许菌体划线接种培养大肠杆菌。 培养基及接种操作1培养基(1)概念：为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。(2)种类：按物理性质分：(3)营养成分：各种培养基一般都含有水、
2、碳源、氮源和无机盐等，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的pH使之满足微生物生长的需要。 2接种(1)概念：在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。(2)常用的接种工具：玻璃刮铲、接种针、接种环等。(3)接种方法：用接种针进行穿刺接种。用接种环进行斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种。用玻璃刮铲涂抹平板接种等。3无菌操作(1)接种前：对所用试管、培养皿和微生物培养基进行灭菌。(2)接种时：在酒精灯火焰附近进行。(3)消毒和灭菌：消毒灭菌概念用较为温和的物理学方法或化学方法杀灭物体上绝大多数微生物的方法采用强烈的物理学或化学方法使物体内外所有的微生物永远丧失生长和繁殖能力的
3、方法。包括干热灭菌和湿热灭菌等方法杀灭效果绝大多数微生物所有微生物适用对象操作空间、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等1下面是察氏培养基(培养霉菌所用)的主要成分，请根据下述培养基，回答下列问题：成分质量/g成分质量/g蔗糖20MgSO47H2O0.5NaNO33FeSO40.01K2HPO41琼脂20KCl1水定容至1 000 mL(1)该培养基根据物理性质划分应是什么培养基？为什么？提示：固体培养基。因为该培养基加入了凝固剂琼脂。(2)该培养基包含微生物生长和繁殖所需要的几类营养物质？分别是什么？提示：4种成分。分别是碳源、氮源、无机盐和水。(3)蔗糖提供的是哪类营养物质？NaNO3
4、提供的是哪类营养物质？提示：蔗糖提供的是碳源。NaNO3提供的是氮源和无机盐。(4)在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物所需要的哪些条件？提示：满足微生物生长对pH、特殊营养物质等的需要。2为什么要对培养基、接种环、实验空间、一些液体等进行消毒或灭菌处理？提示：培养某种微生物的目的是获得数量较多的、单一的该种微生物，如果不进行消毒或灭菌，则会出现其他一些杂菌，影响微生物的纯度。3无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。1培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制
5、。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾磷酸二氢钾。特别提醒(1)营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用。(2)各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH约为6.57.5、放线菌的适宜pH约为7.58.5、真菌的适宜pH约为5.06.0。2培养基的成分营养物质作用功能主要来源碳源能为微生物代谢提供碳元素构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源能为微生物的代谢提供氮元素合成蛋白
6、质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子是生长必不可少的酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水是生命活动所必需的不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无机化合物特别提醒某些微生物的代谢及特点硝化细菌：自养，需NH3或亚硝酸盐做氮源。圆褐固氮菌：异养，培养基中不需加氮源。金黄色葡萄球菌：异养，培养基中需加高浓度食盐。破伤风杆菌：异养厌氧。大肠杆菌的接种与分离培养1配制牛肉膏蛋白胨培养基2斜
7、面接种和培养大肠杆菌斜面接种大肠杆菌的主要目的有菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。具体操作：3平板划线分离和培养大肠杆菌(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作：在酒精灯火焰旁一只手拿着装有培养基的锥形瓶，另一只手拔出瓶塞，使瓶口迅速通过火焰23次，并转动瓶口，确保瓶口被灭菌。再取无菌培养皿，在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于锥形瓶瓶口的缝隙，将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中。等平板冷却凝固后，将平板倒置备用。(2)平板划线分离与培养大肠杆菌：平板划线法的含义：用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的方法。注意事项：接种和划线操作时需要在酒精灯火焰附近进行。
8、培养结果：可以得到由单个细菌增殖而形成的菌落。1将培养基分装到试管中时，为什么培养基的高度约为试管长度的1/5?提示：培养液加入试管的量为总容积的1/5，其目的是为了后面的搁置斜面操作，而搁置斜面的目的是增大培养基表面积，以接种更多的微生物。2为什么要在酒精灯火焰附近接种？提示：酒精灯火焰附近的局部高温使微生物难以存活，可避免接种过程中被其他杂菌污染。3接种24 h后培养基上长出了什么？肉眼看到的一个菌落肯定是由一个大肠杆菌生长和繁殖形成的吗？提示：菌落。不一定，因为当两个或多个细胞连在一起时，在平板上得到的还是一个菌落。1倒平板操作的注意事项(1)培养基要冷却到50 左右时开始倒平板。其原因
9、是琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不能及时操作，琼脂会凝固。(2)要使锥形瓶的瓶口通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能
10、在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。(6)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。2几种常用的划线方法及注意事项(1)划线方法：(2)交叉划线中的注意事项：从操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束后，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的见下表：项目第一次划线之前每次划线之前划线结束目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者从第二次的划线操作后的每次划线总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加逐渐减少，最终得到单
11、个细菌繁殖而来的菌落。特别提醒(1)菌种管和接种管打开要迅速，接种完毕要及时用棉塞塞紧，以免被杂菌污染。(2)操作过程中注意温度的控制，不要杀死大肠杆菌。(3)划线动作要轻，不要划破培养基表面。 以具体的实例为载体，考查培养基的成分例1下表是某微生物培养基成分，请据此回答：编号成分粉状硫(NH4)2SO4K2HPO4MgSO4FeSO4CaCl2H2O含量10 g0.4 g4.0 g9.25 g0.5 g0.5 g100 mL(1)上表培养基可培养的微生物类型是_。(2)若不慎将过量NaCl加入培养基中，如不想浪费此培养基，可再加入_，用于培养_。(3)若除去成分，加入(CH2O)，该培养基可
12、用于培养_。(4)表中营养成分共有_类。(5)不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是_。(6)上表中各成分质量确定的原则是_。(7)若上表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是_。思路点拨精讲精析题表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可判断培养的微生物是自养型微生物。该培养基中加入了过量食盐，就可以培养耐盐的金黄色葡萄球菌，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基还需要加入有机碳源。该培养基若加入(CH2O)，培养基中就有了碳源，但除去成分，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了
13、。微生物生长需要一定的pH，所以培养基装瓶前需要调节pH。培养基中各成分含量要根据微生物的生长需要来确定。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，故需要加入常见的凝固剂琼脂。答案(1)自养型微生物(2)含碳有机物金黄色葡萄球菌(3)固氮微生物(4)三(5)调节pH(6)依微生物的生长需要确定(7)琼脂(或凝固剂)微生物的营养物质归纳(1)自养型微生物的碳源是无机碳(如CO2)，异养型微生物的碳源是有机碳(如糖类)，由此可见培养不同类型的微生物，所用的培养基的组成成分不同，但一般微生物所需的营养物质可分为五类：碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。(2)对异养微生物来说，含C、H、O、
14、N的化合物既是碳源又是氮源和能源。(3)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。(4)一些天然物质如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子。(5)有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为它的特殊营养物质。下表是对四种生物的能源、碳源、氮源、新陈代谢类型的描述，正确的一组是()选项项目硝化细菌乳酸菌根瘤菌衣藻A能源NH3乳酸N2光能B碳源CO2糖类等糖类等CO2C氮源NH3N2N2NOD代谢类型自养需氧型异养厌氧型自养需氧型自养需氧型解析：选B从能源来看，乳酸菌需糖类等有机物供能；从氮源看，乳酸
15、菌需要NH、NO； 从代谢类型看，根瘤菌为异养需氧型；从碳源看，硝化细菌与衣藻需CO2，乳酸菌和根瘤菌需糖类等有机物。微生物接种与分离方法例2(江苏高考)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是()A培养基分装到培养皿后进行灭菌B转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线C接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养D培养过程中每隔一周观察一次精讲精析本题考查微生物的分离和培养。A项应在培养基分装到培养皿前进行灭菌。B项中，从前一区域划线的末端开始往后一区域内划线之前，需要灼烧接种环。C项中有机废水中的微生物只能利用现成的有机物，不能进行光合作用，没有必要放在光照培养箱中培养。D项中微
16、生物的繁殖速度很快，应培养24 h后观察和记录结果。答案B 课堂回扣练习1下列叙述正确的是()A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基D微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌解析：选A培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。培养基的种类根据划分依据的不同而不同，如根据化学成分可分为天然培养基和合成培养基。固体培养基是液体培养基添加凝固剂形成的，其他成分均相同。单个的微生物形体微小，肉眼无法看到，必须借助仪器才能看到，在固体培养基上用肉眼观察到的是一个菌落。2细
17、菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法可分别用于杀灭哪些部位的杂菌()A接种针、手、培养基B高压锅、手、接种针C培养基、手、接种针 D接种针、手、高压锅解析：选C培养基通常用高压蒸汽灭菌，常用酒精擦拭对手进行消毒，接种环、接种针等用火焰灼烧的方法进行灭菌。3右面是微生物平板划线示意图，划线的顺序为12345。下列操作方法正确的是()A操作前不用做任何处理B划线操作必须在火焰上进行C在每个区域中都可以得到所需菌落D在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌解析：选D每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上
18、的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目减少，以便得到菌落。划线后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。4下列关于微生物营养物质的描述正确的是()A同一种物质不可能既作碳源又作氮源B除水以外的无机物仅提供无机盐C凡是碳源都能提供能量D无机氮源也能提供能量解析：选D对异养型微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源又是氮源，如蛋白胨既是碳源又是氮源和能源。除水以外的无机物种类繁多，对不同的微生物起的作用可能不同，如CO2是光能自养细菌的碳源，但不能提供能量；NaHCO3可作为自养型微生物的碳源和无机盐；硝化细菌所利用的氮源
19、是无机氮源氨，同时氨也为硝化细菌提供用于化能合成作用的能源。5为验证某种中药牙膏是否像其广告宣传的一样具有较强的抑菌功效，老师带领生物兴趣小组的同学设计了如下实验(实验过程符合无菌操作要求)：用无菌水漱口，向漱口液中加入适量的该中药牙膏；配制牛肉膏蛋白胨固体培养基；将上述样品接种到培养基上，在适宜条件下进行培养；一段时间后，对培养结果进行观察并进行菌落计数。请分析上述实验过程并回答下列问题：(1)培养基中牛肉膏的作用主要是为微生物生长提供_等营养物质；培养基灭菌常用的方法是_。(2)如何证明所用培养基已经彻底灭菌？_。(3)请指出本实验设计中的一个明显的错误，并加以改正。_。解析：该实验的目的
20、是检验某中药牙膏是否有抑菌功效。从实验的操作可以看出，该实验缺乏对照，应该将漱口液分为两份，一份加牙膏，一份不加牙膏作为对照，其他操作相同。牛肉膏既是碳源也是氮源，还能为细菌生长提供磷酸盐和维生素。培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。单独将没接种的培养基进行培养，如果没有菌落产生，说明灭菌彻底，如果有菌落产生，说明还有残菌未被杀灭。答案：(1)碳源、氮源、磷酸盐、维生素高压蒸汽灭菌法(2)对未接种的培养基进行培养，如无菌落出现，则证明培养基灭菌彻底(3)没有设置对照实验；应将漱口液分为两份，一份加牙膏，一份不加牙膏分别接种培养课下综合检测一、选择题1不同培养基的具体配方不同，但一般都含()A碳源
21、、磷酸盐和维生素B氮源和维生素C水、碳源、氮源和无机盐D碳元素、氧元素、氢元素、氮元素解析：选C培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还应考虑pH、特殊营养物质及O2等条件。2下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是()A氮源物质为该微生物提供必要的氮素B碳源物质也是该微生物的能源物质C无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D水是该微生物的营养要素之一解析：选B该微生物以CO2为唯一碳源，但CO2不能为微生物提供能量，不属于能源物质。3高压湿热灭菌的操作顺序应该是()加水排冷气装灭菌物品100 kPa下灭菌加盖0 kPa下排气，打开灭菌锅A BC D解析：选A高压
22、湿热灭菌的使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步骤。装锅是指将待灭菌物品放在灭菌桶中，盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺栓，打开排气阀。4有关培养基配制原则表述正确的是()A任何培养基都必须含有碳源、氮源、矿质元素、水及生长因子B碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素C微生物的生长除受营养因素影响外，还受到pH、氧、渗透压的影响D营养物质的浓度越高越好解析：选C不同的微生物对每种成分的需求不同，所以培养基的成分也各有不同。培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。5细菌培养基的配制步骤是()A配制培养液、分装、调节pH、灭菌、包扎、搁置斜面B配制培养液、灭菌、调节p
23、H、包扎、分装、搁置斜面C配制培养液、调节pH、分装、包扎、灭菌、搁置斜面D配制培养液、灭菌、分装、调节pH、包扎、搁置斜面解析：选C配制细菌培养基时，配制好培养液后应先调节pH，再分装、包扎、高压蒸汽灭菌并冷却后再搁置斜面。6下列有关倒平板操作错误的是()A将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上B使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰C将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上D等待平板冷却凝固后需要倒过来放置解析：选C整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵，因此，灭过菌的培养皿要放在火焰旁；打开的锥形瓶瓶口要迅速通过火焰；培养皿应打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能将培养皿盖完全打开；等待平板冷却凝固后需要倒过来放置。
24、7将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 恒温箱的目的是()A对比观察培养基有没有被微生物利用B对比分析培养基上是否生有杂菌C没必要放入未接种的培养基D为了下次接种时再使用解析：选B通过设计对照实验，目的是为了检测培养基制备是否成功，即是否污染了杂菌。8下列关于对大肠杆菌的接种的叙述不正确的是()A接种环在接种的试管的斜面上轻轻划“S”型曲线B在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基、培养皿和接种环进行消毒C不能将刚刚灼烧过的接种环直接挑取菌种D使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃解析：选B对培养基和培养皿要进行灭菌而不是消毒；因为灼烧过的接种环温度太高，直接接
25、触菌种会将菌种杀死，所以要将接种环接触没有菌种的培养基的顶端待温度降低后再挑取菌种；有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，所以使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。二、非选择题9某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：_、_、_、_、_。其中提供氮源的是_；提供碳源的主要物质是_。(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配
26、制培养基时各成分要有合适的_。在烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止_。(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入_中灭菌，压力_ kPa，温度_，时间_左右。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应_。(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入_，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。(5)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯_(填“内”或“外”)焰灭菌，并且待接种环_后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管在适温下培养，长成菌落后放入_冰箱中保存。解析：(1)牛
27、肉膏蛋白胨固体培养基配方：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂蒸馏水5.0 g10.0 g5.0 g15.0 g1 000 mL由配方可知所需的原料；凡能提供所需氮元素的物质为氮源，牛肉膏、蛋白胨均含氮元素。(2)在配制培养基时营养要协调，按所培养微生物对各种成分的需求确定；在加入琼脂后，要不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。(3)玻璃器皿的灭菌应用高压蒸汽灭菌锅，在压力为100 kPa、温度为121 条件下，灭菌20 min左右。若棉塞上沾有培养基，则易被杂菌污染，应作废。(4)不加水，无从谈起高压蒸汽，还有可能损坏设备。(5)酒精灯外焰温度高，灭菌效果好。灼烧后待冷却再蘸取菌种，否则会烫死菌种造成实
28、验失败。答案：(1)牛肉膏蛋白胨蒸馏水无机盐琼脂蛋白胨、牛肉膏牛肉膏(2)比例搅拌琼脂糊底引起烧杯破裂(3)高压蒸汽灭菌锅100121 20 min废弃(4)适量水(5)外冷却410炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。(2)细菌鉴定：实验流程如下图所示：对配制的液体培养基等需采取_方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为_(填“无机碳”或“有机碳”)。挑选可疑菌落制片后，用_观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。接种可疑菌后，35 培
29、养24 h，液体培养基变浑浊，原因是_。对照组试管中应加入_，与实验组同时培养6 h后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组_(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。对排除的疑似患者及易感人群，可接种炭疽杆菌疫苗，刺激机体产生相应抗体，与产生抗体相关的细胞除T细胞、B细胞外，还有_。解析：培养基应用高压蒸汽方法进行灭菌。炭疽杆菌同化类型为异养型，应选有机碳作为其碳源。微生物个体小，肉眼观察不到，必须借助显微镜才能观察到菌体特征。在液体培养基中，细菌大量繁殖会导致培养液变浑浊；该实验中实验变量为是否加入噬菌体，所以对照组除不加噬菌体外，其他处理都应该和实验组保持一致(即应加入不含噬菌体的生理盐水)。噬菌体可破坏细菌细胞，从而使培养液变清。在特异性免疫的感应阶段，吞噬细胞参与了对抗原的摄取、处理和呈递，效应B(浆)细胞是直接产生抗体的细胞。答案：(2)高压蒸汽(98 kPa蒸汽)有机碳显微镜细菌大量繁殖等量生理盐水低吞噬细胞、效应B(浆)细胞