1、第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 课标内容要求核心素养对接 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。1科学思维：结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。2生命观念：运用结构与功能观等观念理解 PCR 技术的过程、原理、条件等。必备知识聚焦概念 NO.1一、目的基因的筛选与获取1目的基因(1)概念：用于改变_或获得_等的基因。(2)实 例：培 养 转 基 因 抗 虫 棉 用 到 的 目 的 基 因 是_。受体细胞性状预期表达产物Bt抗虫蛋白基因2筛选合适的目的基因(1)较为有
2、效的方法：从相关的_和_的基因中进行筛选。(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了 Bt 基因的_，也对 Bt 基因的表达产物_有了较为深入的了解。(3)认识基因结构和功能的技术方法：_技术、_数据库、_工具。已知结构功能清晰序列信息Bt抗虫蛋白DNA测序遗传序列序列比对3利用 PCR 获取和扩增目的基因(1)原理：_。(2)DNA 复制所需的基本条件：参与的组分在 DNA 复制中的作用 _(体外用高温代替)打开 DNA 双链 DNA 母链提供 DNA 复制的_DNA半保留复制解旋酶模板参与的组分在 DNA 复制中的作用 4 种脱氧核苷酸合成 DNA 子链的原料_催化合成 DNA
3、子链 引物使 DNA 聚合酶能够从引物的_端开始连接脱氧核苷酸DNA聚合酶3(3)过程：基于 PCR 的过程，完成下列问题：过程为_，该阶段的温度为_以上，目的是使双链DNA解聚为_。过程为_，该阶段的温度为_左右，两种引物通过_与两条单链 DNA 结合。过程为_，该阶段的温度为_左右，该过程需要在耐高温的_的催化下，利用_为原料，根据碱基互补配对原则从子链的_端延伸合成新的子链 DNA。(4)仪器：_。(5)鉴定方法：_。变性90单链复性50碱基互补配对延伸72DNA聚合酶4种脱氧核苷酸3PCR扩增仪琼脂糖凝胶电泳二、基因表达载体的构建(第二步)1基因表达载体作用(1)使基因在_中稳定存在，
4、并且遗传给下一代。(2)使目的基因能够_和发挥作用。受体细胞表达2基因表达载体组成基于基因表达载体的结构模式图，完成下列问题：基因表达载体的模式图(1)A_，RNA 聚合酶识别和结合的部位，可以驱动基因转录出 mRNA，B_。(2)C_，转录停止的部位。(3)D_，E_。启动子目的基因终止子复制原点标记基因3构建过程(1)用_的_切割载体。(2)用_限制酶或能产生相同_的限制酶切割目的基因。(3)用_酶将目的基因片段拼接到载体上。适宜限制酶同一种黏性末端DNA连接三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内_和_的过程。2目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入
5、植物细胞花粉管通道法a用微量注射器将含目的基因的 DNA 溶液直接注入_中。b在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将 DNA 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助_进入_。维持稳定表达子房花粉管通道胚囊农杆菌转化法a农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染_植物和_植物；农杆菌的 Ti 质粒上的_能够整合到所侵染细胞的_上。b转化方法：将目的基因插入农杆菌_中，让农杆菌侵染植物细胞。双子叶裸子TDNA染色体DNATi质粒的TDNA(2)目的基因导入动物细胞常用方法：_法。常用受体细胞：_。(3)目的基因导入微生物细胞方法：用_处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，然后将重
6、组表达载体导入其中。常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。显微注射受精卵Ca2四、目的基因的检测与鉴定(第四步)1分子水平的检测(1)通过_等技术检测受体细胞染色体 DNA 上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出 mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行_杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2个体生物学水平的检测：如饲喂法等。PCR抗原抗体判断对错(正确的打“”，错误的打“”)1从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。()2Taq 酶是用 PCR 仪对 DNA 分子扩增过程中常用的一种耐高温的 DNA 连接酶。()提示：Taq
7、酶是耐高温的 DNA 聚合酶。3基因表达载体中启动子是 DNA 聚合酶识别和结合的部位。()提示：启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位。4将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。()5转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。()提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。6可通过 PCR 等技术检测棉花的染色体上是否插入了 Bt 基因。()关键能力突破重难 NO.2核心点一 核心点二 PCR 技术1PCR 扩增的过程(如图)2PCR 扩增的计算：理论上 DNA 数目呈指数扩增。(1)若开始只有一个 DNA 提供模板，则循环 n 次后获得的子代DNA
8、 数目为 2n 个。(2)若开始有 N0个 DNA 提供模板，则循环 n 次后获得的子代 DNA数目为 N02n 个。3比较 PCR 扩增和体内 DNA 复制的异同项目DNA 复制PCR 技术 解旋方式解旋酶催化DNA 在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在 PCR 扩增仪内)酶解旋酶、普通的 DNA 聚合酶等耐高温的 DNA 聚合酶项目DNA 复制PCR 技术 温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行合成的对象DNA 分子DNA 片段或目的基因 相同点(1)模板：均需要 DNA 的两条单链作为模板(2)原料：均为 4 种脱氧核苷酸(3)酶：均需 DNA 聚合
9、酶1PCR 过程中为什么需要引物？提示：引物是一小段单链 DNA 或 RNA，作为 DNA 复制的起始序列，它能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的 DNA 复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在 DNA 合成时 DNA 聚合酶只能从 5端到 3端合成子链。2某同学认为 PCR 过程不同的 DNA 片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由。提示：正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键，将 DNA 分子双链变成单链，不同片段的 DNA 分子中氢键的数量不同导致稳定性不同，因此所需的温度不同。3在利用 PCR 获取和扩增目的基因时
10、，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？提示：第 3 轮1(2020山东潍坊模拟改编)下列关于 PCR 的叙述，正确的是()APCR 是体外复制 DNA 技术，关键酶是解旋酶和 DNA 聚合酶BDNA 聚合酶从引物的 5端开始连接脱氧核苷酸C第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的 DNA 片段D延伸过程需要酶、ATP 和 4 种核糖核苷酸C PCR 体外复制 DNA 不需要解旋酶，需要耐高温的 DNA 聚合酶，A 错误；DNA 聚合酶从引物的 3端开始连接脱氧核苷酸，B错误；第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的 DNA 片段，这段固定长度的序列的数量呈指数扩增，C 正确；PCR 是在较高温度条
11、件下进行的，该过程需要耐高温的 DNA 聚合酶，且 PCR 反应的产物是DNA，因此原料是 4 种游离的脱氧核苷酸，不是核糖核苷酸，也不需要 ATP，D 错误。2如图 a、b、c 均为 PCR 扩增的 DNA 片段，下列有关说法正确的是()A片段 a、b、c 的长度均相同B片段 a、b 只是第一次循环的产物C片段 c 最早出现在第二次循环的产物中D经过 30 次循环后，片段 c 的数量为 230C 图中片段 a、b 只有一种引物，是由原始 DNA 链为模板复制而来，其长度比片段 c 长，A 项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段 a、b，B 项不正确。由于第
12、一次循环的产物只有一种引物，而图中片段 c 有两种引物，则 c最早出现在第二次循环，C 项正确。经过 30 次循环后，得到的 DNA片段总数为 230，这包括图中的片段 a、b，故 D 项不正确。32020 年新型冠状病毒引发的疫情在世界范围内迅速传播。各研发机构迅速进行了针对新型冠状病毒检测和治疗的研发。回答下列问题。(1)科研机构在拿到新型冠状病毒序列后，第一时间就进行了新型冠状病毒核酸检测试剂盒(双重荧光 PCR 法)的开发。这里涉及的 PCR 是利用_的原理，将目的基因加以复制。PCR 技术扩增目的基因的前提是要有_，以便根据它合成_。PCR 扩增的过程：目的基因 DNA_后解链为单链
13、，_与单链相应互补序列结合，然后在_作用下进行延伸，如此重复循环。解析(1)PCR 的原理是 DNA 双链复制。PCR 技术扩增目的基因需要有一段已知目的基因的核苷酸序列，利用该序列合成引物。PCR 扩增的过程：目的基因 DNA 受热变性形成单链，引物与单链相应序列结合，在耐高温的 DNA 聚合酶的催化作用下进行延伸，如此重复循环。答案(1)DNA 双链复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 引物 受热变性 引物 耐高温的 DNA 聚合酶 目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定1目的基因导入受体细胞的方法生物类型方法受体细胞转化过程特点 植物农杆菌转化法 体细胞或受精卵 目的基因插入 Ti 质
14、粒的 T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞插入植物细胞中的染色体 DNA上目的基因表达适用于双子叶植物和裸子植物 生物类型方法受体细胞转化过程特点 植物花粉管通道法体细胞或受精卵 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将 DNA 溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊适用于任何开花植物 生物类型方法受体细胞转化过程特点 动物显微注射法受精卵目的基因表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的转基因动物是采用最多、最有效的方法 生物类型方法受体细胞转化过程特点 微生物Ca2处理法原核细胞Ca2处理微生物细胞使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态将基因表达
15、载体与感受态细胞混合在缓冲液中一定温度下促使该细胞吸收 DNA 分子原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，从而成为最常用的受体细胞2目的基因的检测与鉴定3常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法转基因生物检测方法观察目标 抗虫植物饲喂害虫害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑 抗盐植物盐水浇灌正常生长 抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长1农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的 T-DNA片段？提示：Ti 质粒的 T-DNA 片段可以整合到受体细胞的染色体上。2如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比有什么优点？提示：(1)操作简便；(2)直
16、接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可，其他答案合理也可)3将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。1(2020山东泰安期中改编)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是()A可利用花粉管通道法培育转基因植物B用 Ca2处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态C对于动物来说，受体细胞一般是受精卵D将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法D 可利用花粉管通道法培育转基因植物，A 正确；用 Ca2处理大肠杆菌，使之处于一种能够吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态，B 正
17、确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C 正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用 Ca2处理法，D 错误。2目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是()A目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNAB可采用 PCR 检测目的基因是否转录和翻译C可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质D抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测C 目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA 上是否
18、插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A 错误；PCR 可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原抗体杂交技术，B 错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。应用创新提升素养 NO.3在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同识别序列的限制酶(R1 和 R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。请思考回答：本案例考查学生演绎与推理的科学思维及对实验结果交流与讨论的科学探究能力。(1)该载体是环形 DNA 还是链状 DNA？说明理由。(科学思维)(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有几个？(科
19、学思维)(3)限制酶 R1 与 R2 的酶切位点的最短距离是多少？(科学思维)提示：(1)该载体应为环形 DNA，因为仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度为 800 Kb 的 DNA 片段。(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有 1 个。(3)限制酶 R1 与 R2 的酶切位点的最短距离为 200 Kb。课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 背 诵 1.基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。2.PCR 反应液中需要提供 DNA 模板、分别与两条模板链结合的 2 种引物、4 种脱氧核苷
20、酸和耐高温的 DNA 聚合酶。核 心 语 句 背 诵 3.PCR 反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。4.基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。5.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。6.将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2处理法)。课堂检测巩固素能 NO.41 3 5 2 4 1基因工程主要操作步骤的顺序是()基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的获取ABCD1 3 5 2 4 C 基因工程的主要操作步骤顺序
21、是：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定。2 1 3 4 5 2(2021辽宁省适应性测试)PCR 是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术，与人体细胞内 DNA 分子复制相比，下列有关叙述错误的是()A都遵循碱基互补配对原则BDNA 聚合酶作用的最适温度不同C都是边解旋边复制的过程D复制方式都是半保留复制2 1 3 4 5 C DNA 分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A 正确；PCR 技术是在较高温度条件下进行的，因此 PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需要酶的最适温度较高，B 正确；PCR 技术是在较高温度条件下打开双链后进
22、行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA 复制方式都是半保留复制，D 正确。3 1 2 4 5 3(2020山东枣庄八中月考)以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是()A基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的B表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出 mRNAC基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等D表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因3 1 2 4 5 B 基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A 错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于 mRNA 上，C 错误；表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，
23、D 错误。4 1 2 3 5 4下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是()A培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因B显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是 Ca2处理法D农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法4 1 2 3 5 A 水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A 错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B 正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用 Ca2处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的状态，C 正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道
24、法，D 正确。2 4 5 1 3 5下图是将某细菌的基因 A 导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。2 4 5 1 3 据图回答：(1)获得 A 有两条途径：一是以 A 的 mRNA 为模板，在_酶的催化下，合成互补的单链 DNA，然后在_的作用下合成双链 DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的 mRNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其 DNA 的_序列，再通过化学方法合成所需基因。2 4 5 1 3(2)利用 PCR 技术扩增 DNA 时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4 种脱氧核糖核苷三磷酸和耐高温的DNA 聚合酶，扩增过程可以在 PCR 扩增
25、仪中完成。(3)由 A 和载体 B 拼接形成的 C 通常称为_。(4)在基因工程中，常用 Ca2处理 D，其目的是_。2 4 5 1 3 解析(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以 mRNA 为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链 DNA，然后在 DNA 聚合酶作用下，合成双链 DNA 分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的 mRNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测 DNA 中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR 过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用 Ca2处理，使其处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的状态。2 4 5 1 3 答案(1)逆转录 DNA 聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸(2)引物 模板(A 基因)(3)基因表达载体(4)使其处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的状态点击右图进入 课 后 素 养 落 实 谢谢观看 THANK YOU!