1、第1节 重组DNA技术的基本工具 第3章 基因工程 课标内容要求核心素养对接 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2阐明 DNA 重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和载体三种基本工具。1生命观念：运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。2社会责任：关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。必备知识聚焦概念 NO.1一、基因工程及其诞生与发展1基因工程的概念(1)操作场所：_。(2)操作技术：_等技术。(3)操作结果：赋予生物新的_，创造出更符合人们需要的新的_和生物产品。(4)操作水平：_水
2、平。生物体外转基因遗传特性生物类型DNA分子2基因工程的诞生和发展(1)基因工程的诞生1944 年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了_，还证明了_。1953 年，沃森和克里克建立了_模型并提出了_的假说。1961 年，尼伦伯格和马太破译了_。遗传物质DNA可以在同种生物的不同个体之间转移是DNADNA双螺旋结构遗传物质自我复制第一个编码氨基酸的密码子20 世纪 70 年代初，_酶、_酶和_酶被相继发现，为 DNA 的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973 年，科学家证明_可以作为基因工程的载体，构建_，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。多种限制DNA连接逆
3、转录质粒重组DNA(2)基因工程的发展1982 年，第一个基因工程药物_被批准上市。1984年，我 国 科 学 家 朱 作 言 领 导 的 团 队 培 育 出_。1985 年，穆里斯等人发明_，为获取目的基因提供了有效手段。重组人胰岛素世界上第一条转基因鱼PCR1990 年，_计划启动。2003 年，该计划的测序任务顺利完成。21 世纪以来，科学家发明了多种_，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。2013 年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的_技术编辑了哺乳动物基因组。人类基因组高通量测序技术基因组编辑二、DNA 重组技术的基本工具1限制性内切核酸酶(简称限制
4、酶)“分子手术刀”(1)来源：主要来自_。(2)功能：能够识别双链 DNA 分子的特定_，并使每一条链中特定部位的_断开。(3)结果：产生_或_。原核生物核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端(4)应用：已知限制酶 EcoR 和 Sma 识别的碱基序列和酶切位点分别为 GAATTC 和 CCCGGG，在图中写出两种限制酶切割DNA 后产生的末端并写出末端的种类。EcoR 限制酶和 Sma 限制酶识别的_不同，切割位点_(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有_。碱基序列不同专一性2DNA 连接酶“分子缝合针”(1)作用：将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_。磷酸二
5、酯键(2)种类填表种类比较E.coli DNA 连接酶T4 DNA 连接酶 来源_ 特点只能连接_既可以连接黏性末端，又可以连接_大肠杆菌T4噬菌体黏性末端平末端3基因进入受体细胞的载体“分子运输车”(1)质粒质粒的本质：是一种裸露的、结构简单、独立于_或_之外，并具有_能力的环状双链 DNA分子。真核细胞细胞核原核细胞拟核DNA自我复制质粒适于作基因运载体的特点a质粒 DNA 分子上有一个至多个_位点，供外源 DNA片段插入其中。b携带外源 DNA 片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中_，或_，随_同步复制。c 人 工 改 造 的 质 粒 常 带 有 _，便 于_。(2)噬菌体、动植物病毒等
6、。限制酶切割进行自我复制整合到受体DNA上受体DNA标记基因重组DNA分子的筛选三、DNA 的粗提取与鉴定1实验原理(1)DNA、RNA、蛋白质和脂质等在_方面有差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA 不溶于酒精，某些蛋白质溶于_，分离 DNA 和蛋白质。DNA 能溶于_mol/L 的 NaCl 溶液。(2)DNA 遇_试剂会呈现蓝色。物理和化学性质酒精2二苯胺2方法步骤(1)研磨：取 30 g 洋葱切碎，倒入 10 mL_研磨。(2)除杂：漏斗中垫上纱布过滤后，在 4 冰箱中静置后取_，也可以 1 500 r/min 的转速下离心后取_。研磨液上清液上清液(3)提取：加入体积相
7、等、体积分数 95%酒精，溶液出现白色的丝状物是_。方法一：用玻璃杯按_(填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。方法二：10 000 r/min 的转速下离心 5 min，取_晾干。DNA一个沉淀物(4)鉴定：项目AB 2 mol/L 的 NaCl 溶液 5 mL 丝状物或沉淀物不加加入 _试剂 4 mL_加热 5 min 现象无色_二苯胺沸水中蓝色判断对错(正确的打“”，错误的打“”)1基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。()2DNA 聚合酶也可以用作 DNA 重组技术的工具。()提示：DNA 重组技术的工具有限制酶、DNA 连接酶和载体，没有
8、DNA 聚合酶。3限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。()提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源 DNA，使之失效，从而保护自身。4不同 DNA 分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。()5DNA 连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。()提示：E.coli DNA 连接酶不能连接平末端。6载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是 DNA 病毒。()关键能力突破重难 NO.2核心点一 核心点二 基因工程的工具酶1限制性内切核酸酶(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面能够识别双链 DNA 分子中特定的核苷酸序列。能够切割特定序列中的特定位点。(2)识别序
9、列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链 DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。如GCCGGCCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。(3)作用产物：黏性末端或平末端。黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时形成的，如图所示：平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：2DNA 连接酶(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的 DNA 片段“缝合”成新的 DNA 分子。(2)连接方式：DNA 连接
10、酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA 连接酶与碱基之间的氢键形成无关。3与 DNA 相关的五种酶的比较名称作用部位作用结果 限制酶 磷酸二酯键将 DNA 切成两个片段 DNA连接酶磷酸二酯键将两个 DNA 片段连接为一个 DNA 分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端名称作用部位作用结果 DNA(水解)酶磷酸二酯键将 DNA 片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链 DNA 分子局部解旋为单链，形成两条长链1为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不
11、会切割自己的 DNA 分子？提示：原核细胞容易受到外源 DNA 的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源 DNA 而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的 DNA 分子，因为酶具有专一性或自己的 DNA 分子已被修饰而不被识别。2限制性内切核酸酶和 DNA 连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制性内切核酸酶能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coli DNA 连接酶能将具有互补黏性末端的 DNA 片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA 连接酶既可以连接双链 DNA 片段互补的黏性末端，又可以连
12、接双链 DNA 分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此 DNA 连接酶的作用没有体现酶的专一性。1(2020河北沧州一中高二月考)限制酶和 DNA 连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是()A.DNA 连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B.限制酶只能切割双链 DNA 片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸C.E.coli DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNAB DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片段，A 项错误；限制酶只能切割双链 DNA 片段而不能切割 RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，
13、B 项正确；E.coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C 项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物 DNA 分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的 DNA，D 项错误。2(2020北京密云区期末改编)下列各种酶及其作用对应关系不正确的是()A.限制酶识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开B.RNA 聚合酶与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译C.DNA 连接酶将分开的 DNA 片段通过特定末端连接在一起D.DNA 聚合酶将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上B 限制酶能识别双链 DNA
14、 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，A 正确；RNA 聚合酶与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B 错误；DNA 连接酶将两个DNA 片段连接在一起，在两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键，C 正确；DNA 聚合酶将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键，D 正确。几种酶的作用部位图解(1)作用于 a(磷酸二酯键)的酶：限制酶(断开)、DNA 连接酶(形成)和 DNA 聚合酶(形成)。(2)作用于 b(氢键)的酶：解旋酶(断开)。基因工程中常用的载体1特点：质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的环状双链 DNA 分子。2本质：质粒是独立于
15、真核细胞细胞核或原核细胞拟核 DNA 之外的小型 DNA 分子，不是细胞器。3质粒作为载体所具备的条件条件分析 稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大 有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因便于重组 DNA 的鉴定和选择无毒害作用避免受体细胞受到损伤4标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示：细胞膜上的载体与基因工程中的
16、载体有什么不同？提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。1作为基因的运输工具载体，必须具备的条件之一及理由是()A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D.对宿主细胞无伤害，以便于重组 DNA 的鉴定和选择A 作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保
17、存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A 正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B 错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组 DNA 的筛选，C 错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D 错误。2某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的 a、b、c 是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况 能生长能生长能生长不能生长不能生长能生长A.是 c；是 b；
18、是 aB.是 a 和 b；是 a；是 bC.是 a 和 b；是 b；是 aD.是 c；是 a；是 bA 细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是 c；细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为 b；细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为 a。应用创新提升素养 NO.3某线性 DNA 分子含有 5 000 个碱基对(bp)，先用限制酶 a 切割，再把得到的产物用限制酶 b 切割，
19、得到的 DNA 片段大小如下表。限制酶 a 和 b 的识别序列和切割位点如下图所示。a 酶切割产物(bp)b 酶再次切割产物(bp)2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500本案例考查演绎与推理的科学思维。(1)该 DNA 分子上有几个 a 酶识别和切割的位点？有几个 b 酶识别和切割的位点？(科学思维)(2)a 酶和 b 酶切出的黏性末端能相互连接吗？(科学思维)提示：(1)该 DNA 分子上有 3 个 a 酶识别和切割的位点；有 2 个b 酶识别和切割的位点。(2)a 酶和 b 酶切出的黏性末端相同，因此能相连。课堂小结知 识 网 络
20、 构 建核 心 语 句 背 诵 1.基因工程的基本原理是基因重组，外源 DNA 能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。2DNA 重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。3限制性内切核酸酶可识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。核 心 语 句 背 诵 4E.coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，而 T4 DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。5质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。6在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植
21、物病毒等。课堂检测巩固素能 NO.41 3 5 2 4 1(2020黑龙江哈师大附中月考改编)下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是()A.同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性B.限制酶只能识别和切割 DNA，不能识别 RNAC.限制酶与 DNA 连接酶的作用部位不相同D.限制酶只能从原核生物中提取1 3 5 2 4 B 一种限制酶能识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割 DNA 分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A 错误；限制酶与 DNA 连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C 错误；限制酶主要从原核生物中提取，D 错
22、误。2 1 3 4 5 2下列关于 DNA 连接酶的叙述，正确的是()A.DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片段碱基对之间的氢键B.DNA 连接酶连接的是 DNA 单链上的磷酸和脱氧核糖C.DNA 连接酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端D.E.coil DNA 连接酶能将双链 DNA 片段互补的平末端连接起来2 1 3 4 5 B DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片段之间的磷酸二酯键，A错误；DNA 连接酶连接的是 DNA 双链片段两个脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖，B 正确、C 错误；E.coli DNA 连接酶只能将具有互补黏性末端的 DNA 片段连接起来，D 错误。3 1
23、 2 4 5 3质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是()A.质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B.质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点C.质粒为小型环状 DNA 分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中D.质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制3 1 2 4 5 A 质粒为小型环状 DNA 分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状 DNA 分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。4 1 2 3 5 4(2019江苏
24、扬州中学高三月考改编)下列关于 DNA 粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的 DNA 量相近B.DNA 析出过程中，搅拌操作要轻柔以防 DNA 断裂C.预冷的酒精溶液可用来粗提取 DNAD.用二苯胺试剂鉴定 DNA 需要进行沸水浴加热4 1 2 3 5 A 兔属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到 DNA，A 项错误；DNA 分子从细胞中被释放出来且除去蛋白质后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA 链可能会被破坏，因此沿一个方向轻柔搅拌的目的是获得较完整的 DNA 分子，B 项正确；在预冷的体积分数为 95%的酒精溶液中 DNA
25、的溶解度最低，DNA 的沉淀量最大，C 项正确；将析出的 DNA 溶解在物质的量浓度为 2 mol/L 的 NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才会呈现蓝色，D 项正确。2 4 5 1 3 5如表所示为 4 种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题：2 4 5 1 3(1)从表中 4 种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是_。(2)限制酶切割的 DNA 片段的缝合依靠的是_酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过_连接起来。(3)图 1 中的质粒分子可被表中限制酶_切割。图 12 4 5 1 3 图 2(4)在相关酶的作用下，图 1 中的甲与图 2 中的乙_(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：_。2 4 5 1 3 解析(1)由表中 4 种限制酶的切割位点可知，Sma 可切出平末端。(2)限制酶切割的 DNA 片段缝合时用 DNA 连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶 EcoR 切割，切割后形成链状 DNA。(4)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在 DNA连接酶的作用下可以拼接起来。答案(1)Sma (2)DNA 连接 氢键(3)EcoR (4)能 二者具有相同的黏性末端点击右图进入 课 后 素 养 落 实 谢谢观看 THANK YOU!