1、实验1大肠杆菌的培养和分离学考报告知识内容考试属性考情解读大肠杆菌的培养和分离加试1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理一、大肠杆菌1大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。2在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。3大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。二、实验内容1本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表
2、达量菌株的最简便方法之一。2本实验用LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。三、细菌的培养和分离1细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。2细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。在固体培养基培养1020 h后，
3、可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释105107倍，然后取0.1 mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养。在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。(3)细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。四
4、、灭菌操作1各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2压力、121 、15 min)处理，并在超净台上使用。注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。2各种培养基必须是无菌的。3细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤1在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。2灭菌后待培养基冷却至60 时，关闭紫外灯，点燃酒精
5、灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。3扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37 每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。4划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到在摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 恒温培养箱中培养1224 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。5在无菌操作下将单菌落用接
6、种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养24 h后，置于4 冰箱中保存。1如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？提示：(1)胆大心细，操作快捷；(2)注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率；(3)注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37 ；霉菌喜酸，喜糖，喜2530 。2在培养后如何判断是否有杂菌污染？提示：(1)从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠、颜色等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌关键指标；(2)显微镜观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌关键指标；(3)上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态
7、观察，如用革兰氏染色法等。3进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？提示：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较大，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理？提示：所有接触过细菌的器皿都要先高压蒸汽灭菌后再洗涤(特别是培养基)；使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃。5如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？提示：转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。微生物培养的基本条件1培
8、养基(1)含义：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)种类划分标准培养基种类特点用途物理液体培养基不加凝固剂工业生产性质半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类、鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物(3)成分：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等最基本的物质，有时还需要加入特殊的营养物质。2无菌技术(1)含义：无菌技术不仅能防止实验室的培养物
9、被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。(2)无菌操作对实验空间、操作台可用紫外线或酒精消毒，操作者的手用酒精消毒。实验用的培养器皿和培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(1)不同种类微生物需要的培养基不同，但各种培养基配制完成后均需严格灭菌。(2)培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法，但如果培养基中含有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500 g/cm2压力(90 以上)灭菌30 min；有些不能加热灭菌的化合物，如
10、尿素等只能用G6玻璃砂漏斗过滤。(3)配制固体培养基时，需要添加凝固剂，如琼脂，但凝固剂不止琼脂一种。1下列有关微生物培养条件的叙述，不正确的是()A分离微生物常用固体培养基，扩大培养常用液体培养基B“细菌喜荤，霉菌喜素”，培养基中成分的含量和配比因培养物而异C培养基的灭菌均采用高压蒸汽灭菌法，即在121 (1 kg/cm2压力)下灭菌15 minD制作固体培养基时常常加入琼脂解析：选C。培养基的灭菌通常是采用高压蒸汽灭菌法，但因培养基的成分而异。如培养基中有葡萄糖，高压蒸汽条件下会导致葡萄糖分解碳化，而采用500 g/cm2压力灭菌30 min。2细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球
11、擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A接种环、手、培养基B高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环D接种环、手、高压锅解析：选C。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。消毒和灭菌的比较项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品紫外线消毒法接种室、超净台化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器
12、皿、金属工具高压蒸汽灭菌法培养基及容器灭菌过滤灭菌不能加热灭菌的化合物，要用G6玻璃砂漏斗过滤 大肠杆菌的培养和分离1LB培养基的制备(1)计算：根据LB培养基配方的比例，计算配制50 mL 的培养基时各种成分的用量。(2)称量：准确地称取各种成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化钠0.5 g，加水50 mL。(如配LB固体培养基，则再加1 g 琼脂)(3)制备空白斜面：将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2 mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。灭菌后斜靠在平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。2进行大肠杆菌培养
13、与分离操作(1)灭菌(2)制备LB固体平面培养基倒平板操作待培养基冷却至60 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作描述如下：(3)扩大培养左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。三角瓶在37 摇床振荡培养12 h。(4)划线分离取种在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。平板划线操作在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示)，划线后盖好培养皿。培养将上述划线操作后的培养皿倒
14、置放至37 恒温培养箱中培养1224 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。(5)菌种纯化与保藏在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37 培养24 h后，4 冰箱保存即可。划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)，从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。请结合图示，回答下列有关大肠杆菌分离与纯化的问题
15、：(1)稀释用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL_的大试管中，充分混匀，稀释_倍；按照同样的方法依次进行稀释制成101、102、103、104、105、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。(2)划线或涂布划线分离法a操作：在_旁，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线。b划线方法：_划线和_划线。c平行划线时，第一次划线及每次划线之间都要灼烧接种环，划线结束后也要灼烧接种环，目的分别是什么？涂布分离法a操作：取0.1 mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。b图示：(3)培养：将接种的平板_于培养箱
16、或温室中37 培养1224 h。答案：(1)无菌水10(2)a.酒精灯火焰b平行连续c.第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束时灼烧目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者(3)倒置大肠杆菌培养和分离的注意事项在倒平板过程中，不能将培养基溅在皿壁与皿盖上，防止杂菌污染。本实验需设置空白培养基在相同条件下一起培养，以确定是否有杂菌污染。培养皿倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基中难以形成单菌落。实验操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培
17、养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 一、选择题有关大肠杆菌营养物质的叙述中，正确的是()A是碳源的物质也可能同时是氮源B凡碳源都提供能量C除水以外的无机物只提供无机盐D无机氮源也能提供能量解析：选A。是碳源的物质也可能同时是氮源，如碳酸氢铵、氨基酸等，既能为微生物提供碳源，同时也能提供氮源；凡碳源未必能为大肠杆菌提供能量，如无机的碳源；除水以外的无机物
18、可能同时具有提供无机盐、碳源和氮源等多重作用；无机氮源对硝化细菌可以提供能量，但是对大肠杆菌不能提供能量。在光照下，将等细胞数量的衣藻和大肠杆菌分别接种到只含无机盐的培养液中培养，结果是(虚线和实线分别表示大肠杆菌和衣藻的生长曲线)()解析：选C。衣藻是低等植物，能利用无机盐进行光合作用自己合成有机物。大肠杆菌是异养生物，不能自己制造有机物只能摄取现成有机物，在只含无机盐的培养基上几乎不能生长。培养基配制需要运用灭菌和消毒技术，但两者消灭的微生物种类和数量是不同的，下列哪一项能正确表示消毒结果和灭菌结果之间的关系()解析：选B。消毒的目的是杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭
19、菌则是杀死物体内外所有的微生物，包括孢子和芽孢。所以，一般来说，灭菌的结果应包含消毒的结果，故选B。下列所述环境条件下的微生物，能正常生长繁殖的是()A在缺乏生长素的无氮培养基中的圆褐固氮菌B在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌C在新配制的植物矿质营养液中的酵母菌D在灭菌后的动物细胞培养液中的禽流感病毒解析：选A。圆褐固氮菌是自生固氮菌，能合成生长素满足自身生长。破伤风杆菌是严格厌氧生活的细菌，在表皮不能生长。在新配制的植物矿质营养液中由于缺乏有机物，因此不能培养酵母菌。禽流感病毒营严格的胞内寄生生活，在灭菌后的动物细胞培养液中不能培养禽流感病毒，通常在活的鸡胚细胞中进行培养。有关涂布分离法的叙述，
20、错误的是()A首先将菌液进行一系列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C其核心是防止杂菌污染，保证培养液的纯度D结果都是在培养基表面形成单个的菌落解析：选D。涂布分离法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释倍数的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释倍数足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌，从而能在培养基表面形成单个的菌落。下列关于微生物的培养和运用的叙述，错误的是()A通过消毒不能杀死物体内所有的微生物B利用划线分离法可以统计样品中活菌的数目C划线分离法和涂布分离法常用于微生物的接种D微生物所用的培养基成分和植物组织培养用的培养基
21、成分不同解析：选B。消毒是指杀死病原微生物，但不一定能杀死细菌芽孢的方法。统计样品中活菌的数目要用涂布分离法，划线分离法办不到。不同的培养对象，所需的营养成分不同，培养基中加入的物质也就不同。微生物接种最常见的方法是划线分离法和涂布分离法。下图是利用牛肉膏蛋白胨培养基培养和纯化X细菌的部分操作步骤。有关叙述正确的是()A步骤中，倒好平板后应立即将其倒置，防止水蒸气落在培养基上污染培养物B步骤接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液 C步骤沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现的单个菌落计数 D步骤是将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都是X细菌的
22、菌落答案：B能排除培养基是否有杂菌污染的方法是()A将未接种的培养基放在实验桌上培养B将未接种的培养基放在窗台上培养C将未接种的培养基放在恒温箱中培养D将已接种的培养基放在恒温箱中培养解析：选C。排除杂菌污染的常用手段是将未接种的培养基放在恒温箱中培养。下列有关微生物的培养或纯化的叙述，错误的是()A微生物在培养前要先对培养基进行灭菌处理再接种B培养液中溶氧量的变化会影响酵母菌的繁殖和代谢途径C大肠杆菌的纯化培养包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段D分离自养型微生物的方法是用纤维素作为唯一碳源的培养基解析：选D。微生物在培养前要先对培养基进行灭菌处理，常用高压蒸汽灭菌法灭菌，注意要冷却后再接
23、种。分离自养型微生物时，培养基中不用加碳源，利用空气中的CO2即可。下列操作中，需用到接种环的是()A平板划线操作B梯度稀释操作C涂布平板操作D倒平板操作解析：选A。平板划线操作需用到接种环。在涂布平板操作时错误的是()A将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红B取少量菌液滴加在培养基表面C将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却810 s再用D涂布时可转动培养皿，使涂布均匀答案：A酵母菌培养液常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是()A碳源供应太充足B葡萄糖不是酵母菌的原料C改变了酵母菌培养液的pHD细胞会发生质壁分离解析：选D。当培养基中葡萄糖的
24、浓度升高时，会导致培养液的渗透压升高，从而导致细胞发生质壁分离。用涂布分离法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值比()A比实际值要高B比实际值要低C和实际值一样D比实际值可能高也可能低解析：选B。涂布分离法统计活菌的数目时，由于在培养的过程中有细菌会死亡，还有很多细菌聚集在一起，导致其菌落也聚集在一起，统计时只能算一个，这样都会造成统计的结果比实际的值要低。将配制好的培养基进行灭菌应用()A灼烧灭菌B高压蒸汽灭菌C干热灭菌D煮沸灭菌解析：选B。对配制好的培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌。某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是()A培养基分装到培养皿后进行灭菌B转换划线
25、角度后需灼烧接种环再进行划线C接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养D培养过程中每隔一周观察一次解析：选B。培养基灭菌后再分装到培养皿中；转换划线角度前要灼烧接种环，冷却后再从上次划线的末端开始进行划线；接种后的培养皿需放在恒温箱中进行培养，一般每隔12 h或24 h观察一次。有关平板划线操作的叙述，不正确的是()A第一次灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种C在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者解析：选C。第一次灼烧接种
26、环，这是为了避免接种环上可能存在的微生物对实验过程带来污染。每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，防止对接种过程带来污染。在第二区域内划线时，接种环上的菌种来源于第一接种区。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者，使实验过程更安全。在培养微生物的培养基中加入某些物质能分离出所需的微生物。下列选项中，前者是在培养基中加入的物质，后者是能被分离出的微生物，其中正确的是()A氢氧化钠，酵母菌B盐酸，放线菌C适量的青霉素，霉菌D适量的伊红美蓝，大肠杆菌解析：选C。氢氧化钠、盐酸为强碱、强酸，酵母菌和放线菌都不能生存。加入伊红美蓝的培养
27、基是用来鉴定大肠杆菌，并不能分离大肠杆菌。适量的青霉素对原核生物有抑制作用，对真核生物的生命活动并不影响。下面对发酵过程中灭菌的理解不正确的是()A防止杂菌污染B接种前菌种要进行灭菌C培养基和发酵设备都必须灭菌D灭菌必须在接种前解析：选B。在发酵过程中要严格防止杂菌污染，否则将会使培养的微生物不能正常的生长。接种前要对培养基、实验中需要用到的器皿和工具进行灭菌处理，但是菌种不能进行灭菌。广东省微生物菌种保藏中心有各种微生物超过上万种，其中大部分是自己“养”出来的，少部分是引进的，下列有关“养”细菌的叙述，正确的是()A题干中的“养”具有筛选、培养和保藏等含义B在培养基中加入青霉素可筛选出细菌C
28、在固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌D各种细菌的保藏是在液态培养基中进行的答案：A金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒，下列实验结束后的做法错误的是()A对接种环进行灼烧处理B带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉C带菌培养基必须经加热后才能倒掉D接种后双手必须用肥皂洗净，再用75%的酒精棉球擦拭解析：选C。金黄色葡萄球菌有很强的致病力，所以在操作时一定要做到安全防范，接种后双手用肥皂洗净，再用75%的酒精棉球擦拭，以起到杀菌的作用；对接种环进行灼烧也可以杀灭细菌，防止污染环境；高压蒸汽灭菌也可杀死培养基中的金黄色葡萄球菌；如果只对带菌培养基进行加热，杀不
29、尽其中的致病菌，因为此菌的耐高温能力很强，会污染环境。二、非选择题根据所学知识回答问题：(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(3)若用涂布分离法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得
30、的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。解析：(1)大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(2)灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以对培养基和培养皿进行灭菌，消毒是使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分微生物，操作者的双手需要进行清洗和消毒，紫外线能
31、使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。(3)涂布分离法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释倍数的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，应保证样品稀释的比例合适。(4)对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。(6)因为有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重损伤，使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案：(1)温度酸碱度易培养生活周期短(2)灭
32、菌消毒损伤DNA的结构(3)比例合适(4)鉴定(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生(6)灭菌22为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操
33、作时，接种环通过_灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_。(3)示意图A和B中，_表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高_的利用率。解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有(393837)/338个活菌，则每毫升稀释液中活菌的数目为38/0.
34、1380，则稀释前每毫升水样中活菌数目为3801003.8104，则每升水样中活菌数目为3.81041 0003.8107。(2)接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较图A和图B可以看出：A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培
35、养的细菌生长速度快。答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格3.8107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)B(4)溶解氧营养物质炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。(2)细菌鉴定：实验流程如图所示：对配制的液体培养基等需采取_方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为_(填“无机碳”或“有机碳”)。挑选可疑菌落制片后，用_观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。接种可疑菌后，35 培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是_。
36、对照组试管中应加入_，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组_(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染，反之则排除。解析：(2)培养可疑炭疽杆菌之前应先将液体培养基进行高压蒸汽灭菌。由于炭疽杆菌是异养生物，因此培养基中的碳源应是有机碳。观察杆菌应用显微镜。接种可疑菌24小时后，液体培养基变浑浊的原因是细菌大量繁殖。答案：(2)高压蒸汽有机碳显微镜细菌大量繁殖等量生理盐水低苹果干腐病是一种名为茶藤子葡萄座腔菌真菌引起的疾病，病菌通常由枝条伤口入侵感染，在伤口处形成溃疡。某中学的科研小组计划分离出该真菌，并进行药物防治实验，为苹果干腐病的防治提供合理的建议。经过查
37、阅资料，确定了分离时所用的PDA培养基配方，如下表所示：物质马铃薯葡萄糖自来水氯霉素含量200 g20 g1 000 mL0.3 g该真菌在上述PDA培养基上生长时有特定的形态特征：辐射状白色匍匐菌丝，绒毛状。(1)要获得菌落，则上表中还应添加的成分是_。(2)培养基的制备步骤包括计算、称量、溶化、_、倒平板。等平板冷却凝固后，将平板_，以防止冷凝水污染培养基。(3)用剪刀从染病枝条溃疡处剪取11 cm2的患病组织，并用0.1%的升汞进行消毒，置于培养基中心，在合适条件下进行培养，共培养五组。待菌落形态特征稳定后，用_法将该致病菌分别转移至含有等量0.5%苦水碱剂、40%福美砷、清水的上述PD
38、A培养基中进行抗药性实验，并每隔24 h记录一次最后划线区域的菌落数目。答案：(1)琼脂(或凝固剂)(2)灭菌倒置放置(3)平板划线某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。请回答与此实验相关的问题：(1)培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了_和_。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是_和_。(2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_。(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于_中培养，要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种_作为对照进行实验。(4)培养20小时后，观察到平板上有形
39、态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有_种细菌，一般说来，菌落种数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_。(5)如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_细菌，这种培养基被称为_。解析：(1)蛋白胨既可作为碳源又可作为氮源，淀粉为碳源，除了碳源、氮源外，培养基还需含有的基本成分为水和无机盐。(2)在实验室中，采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。(3)为了尽快观察细菌培养结果，就要使细菌快速生长、繁殖，应在适宜温度下进行培养；要使观察结果可靠，必须设置一个对照实验，遵循单一变量原则，单一变量为有无接种细菌，可用无菌水作对照组。(4)菌落是单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的一个肉眼可见的、具有一定形态结构的细胞群体，即种群，不同细菌的菌落特征不同。本题中有形态和颜色不同的菌落，说明湖水样品中有多种细菌，且菌落越多，细菌数量就越多，说明湖水被细菌污染程度越高。(5)耐盐细菌具有很强的抗盐性(如金黄色葡萄球菌)；而其他种类的细菌在高浓度的NaCl溶液中，会因菌体失水过多而死亡，因此，这种培养基可作为选择培养基。答案：(1)碳源、氮源碳源水无机盐(2)高压蒸汽灭菌(3)恒温培养箱无菌水(4)多高(5)盐选择培养基