1、选修 3 现代生物科技专题 思维网络 专题1、4 基因工程、生物技术的 安全性和伦理问题 课标要求命题解读1.简述基因工程的诞生；简述基因工程的原理及技术；举例说出基因工程的应用2.关注转基因生物的安全性问题；举例说出生物武器对人类的威胁；讨论生物技术中的伦理问题3.简述蛋白质工程活动建议：1.观看基因工程的影像资料2.调查基因工程产品在社会中的应用情况，讨论转基因生物的利与弊3.搜集与交流生物技术研究与开发的有关政策和法规1.本部分内容在高考中主要以非选择题的形式进行考查，内容包括基因工程的工具、操作步骤及在实际中的应用及蛋白质工程；考查方式是通过构建基因表达载体来考查基因工程的工具和操作步
2、骤，同时联系细胞工程和胚胎工程进行考查2.命题趋势：以基因工程为主线考查基因工程原理及技术、基因工程应用、蛋白质工程等相关内容，有时结合基因工程在农业、医药生产、疾病诊断和治疗中的应用进行出题，或者与细胞工程、胚胎工程结合出题考情分析考点一 DNA 重组技术的基本工具 考点梳理 1.限制性核酸内切酶原核生物(1)来源：多数来自_。(2)作用特点。主要切割外源 DNA，而对自身的 DNA 不起作用，达到保护自身的目的。专一性：只能识别 DNA 分子中特定的核苷酸序列，且只能在每一条链中特定的部位进行切割。(3)识别序列的特点：限制酶识别的序列大多数为_结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置
3、。(4)作用结果黏性末端和平末端。回文对称黏性末端：是限制酶在它识别序列的中轴线两侧将 DNA的两条链分别切开时形成的(错位切)，如下图所示：平末端：是限制酶在识别序列的中轴线切开时形成的(平切)，如下图所示：(5)作用实质：使特定部位的两个核苷酸之间的_断开。磷酸二酯键限制酶选择的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使 用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 Pst和 EcoR两种限制酶(但要确保
4、质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制 酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶 Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。种类Ecoli DNA 连接酶T4DNA 连接酶来源大肠杆菌T4 噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_键2.DNA 连接酶磷酸二酯3.基因的运输工具载体(1)作用。作为运载工具，
5、将目的基因运入宿主细胞中。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。条件目的稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩增有一个至多个_可携带多个或多种外源基因具有特殊的_便于重组 DNA 的鉴定和选择限制酶切位点标记基因(2)载体必须具备以下三个条件。(3)种类。细菌质粒：细菌拟核 DNA 以外的小型环状 DNA。噬菌体的衍生物和某些病毒的 DNA。4.基因工程的基本原理和理论基础概括(如下图)基础测评 1.下列属于“分子缝合针”的是()DNA 聚合酶DNA 连接酶B.D.E.coil DNA 连接酶解旋酶RNA 聚合酶A.C.答案：B2.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的
6、是()A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒B.DNA 连接酶和 RNA 聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达答案：B考点二基因工程的基本操作程序 考点梳理 基因工程的基本操作程序：1.目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。目的基因的获取 基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定(2)获取方法。直接分离从基因文库中获取利用 PCR 技术扩增人工合成说明：基因文库相当于某种生物的基因仓库，储备着大量该物种的基因。化学合成法：针对已
7、知核苷酸序列的较小基因反转录法：以 RNA 为模板，在反转录酶的作用下人工合成2.基因表达载体的构建重组质粒的构建(1)构建基因表达载体的目的。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用。(2)构建步骤。(3)构建载体主要考虑的因素。具有选择性_：如抗生素抗性基因，以便选择出真正的转基因生物。标记基因启动子用作载体的质粒的插入部位前须有 _，后须有_。终止子使用与获取目的基因相同的限制酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。种类植物动物微生物常用方法_法_技术_法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到 Ti 质 粒 的T-DNA 上
8、农 杆菌导入植物细胞整合到受体细胞中染色体的DNA 上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物2Ca 处 理 细 胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态 细 胞 吸 收DNA 分子农杆菌转化显微注射感受态细胞3.将目的基因导入受体细胞的方法4.目的基因的检测与鉴定 基础测评 1.某蔬菜地栽种了一种抗虫大白菜，是运用转基因技术把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因 DXT 转移到大白菜细胞中培育而成的，在这一过程中要进行基因表达载体的构建。根据所学知识推断，作为重组载体应具备的结构有()A.目的基因、启动子B.目的基因、终止子C.目的基因、启动子、终止子D
9、.目的基因、启动子、终止子、标记基因答案：D2.下图为基因表达载体的模式图，若结构 a 是基因表达载)B.启动子D.DNA 连接酶体所必需的，则 a 最可能是(A.氨苄青霉素抗性基因C.限制酶答案：B3.从浩瀚的“基因海洋”中获得特定目的基因的方法有()从基因文库中获取目的基因PCR 扩增技术扩增RNA 复制B.D.人工合成基因A.C.答案：D表现方面具体内容植物基因工程 提高农作物的抗逆能力；利用转基因改良农作物的品质；利用植物生产药物等动物基因工程提高动物生长速度；用转基因动物生产药物(如乳腺生物反应器)；用转基因动物作器官移植的供体；用于改善畜产品的品质等基因工程药物 控制药品合成的相应
10、基因基因治疗体外基因治疗；体内基因治疗考点三基因工程的应用、生物技术的安全性及蛋白质工程 考点梳理 1.基因工程的应用(1)基因工程的应用举例。(2)基因工程药物。来源：主要来自转基因的工程菌，也可来自各类生物反应器。成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。优点缺点解决粮食短缺问题；大大减少农药的使用量，减少环境污染；增加食物营养，提高附加值；增加食物种类，提升食物品质；提高生产效率，带动相关产业发展可能出现新的过敏原或重组形成新病毒；可能产生抗除草剂的杂草；可能使疾病的传播跨越物种障碍；可能会破坏生物多样性；可能会对
11、人类生活环境造成二次污染2.生物技术的安全性和伦理问题(1)转基因生物的优缺点。(2)试管婴儿与克隆人。试管婴儿和设计试管婴儿的比较。a.不同点：设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿不需进行遗传学诊断或基因诊断。图中是试管婴儿的培育过程，是设计试管婴儿的培育过程。项目治疗性克隆生殖性克隆区别目的治疗人类疾病用于生育，产生新个体水平细胞水平个体水平联系都属无性繁殖；产生的新个体、新组织遗传信息相同应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症等疾病的治疗。b.相同点：都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都属于有性生殖。治
12、疗性克隆和生殖性克隆的比较。(3)生物武器的特点及传播途径。特点：a.传染性强；b.污染面广，危害时间长；c.难以防治；d.具有一定的潜伏期；e.受自然条件影响大。传播途径：a.经食物和水传播；b.空气传播；c.接触传播；d.虫媒传播；e.病原体直接传播。3.蛋白质工程修饰改造(1)概念：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因_或基因合成，对现有蛋白质进行_，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。项目基因工程蛋白质工程操作环境(场所)生物体外生物体外操作核心基因基因操作起点目的基因预期的蛋白质功能(2)蛋白质工程流程图。(3)基因工程和蛋白质工程的比较。项目
13、基因工程蛋白质工程基本过程获取目的基因基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定确定蛋白质功能应有的高级结构应具备的折叠状态应有氨基酸序列应有的碱基序列改造的蛋白质实质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)定向改造或生产人类所需的蛋白质结果生产自然界已存在的蛋白质可以创造出自然界不存在的蛋白质（续表）基础测评 1.蛋白质工程的基本途径是()预期蛋白质功能推测应有的氨基酸序列表达(转录和翻译)形成预期功能的蛋白质合成相对应的脱设计预期的蛋白质结构B.D.氧核苷酸序列(基因)A.C.答案：C2.科学家已能运用基因工程技术，让羊的乳腺合成并分泌
14、人体某些种类的抗体，以下叙述不正确的是()A.该技术可导致定向变异B.表达载体中需要加入乳腺蛋白的特异性启动子C.目的基因是抗原合成基因D.受精卵是理想的受体细胞答案：C3.基因工程与蛋白质工程的区别是()A.基因工程需对基因进行分子水平操作，蛋白质工程不需对基因进行操作B.基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以是自然界不存在的蛋白质C.基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平(或性状水平)操作D.基因工程完全不同于蛋白质工程答案：B考向1限制性核酸内切酶典例1(2019年新课标卷)基因工程中可以通过PCR技 术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以
15、人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_和_。(2)生物体细胞内的 DNA 复制开始时，解开 DNA 双链的酶是_。在体外利用 PCR 技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板 DNA 解链为单链的条件是_。上述两个解链过程的共同点是破坏了 DNA 双 链 分 子 中 的_。(3)目前在 PCR 反应中使用 Taq 酶而不使用大肠杆菌 DNA聚合酶的主要原因是_。解析(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可 以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA 文库。(2)生物体细胞内的 DNA 复制开始时，解开 DNA 双链的酶是解 旋酶。在体外利用 PCR 技术扩增目的基因时
16、，使反应体系中的 模板 DNA 解链为单链的条件是加热至9095。上述两个解 链过程的共同点是破坏了DNA 双链分子中的氢键。(3)目前在PCR 反应中使用Taq 酶而不使用大肠杆菌 DNA 聚合酶的主要 原因是Taq 酶热稳定性高，而大肠杆菌 DNA 聚合酶在高温下会失活。答案(1)基因组文库cDNA 文库(2)解旋酶加热至 9095 氢键(3)Taq 酶热稳定性高，而大肠杆菌 DNA 聚合酶在高温下会失活酶的名称作用化学键生理过程 或应用 DNA 连接酶 连接两个 DNA 片段形成磷酸二酯键基因工程限制性核酸内切酶切割某种特定的脱氧核苷酸序列破坏磷酸二酯键DNA 聚合酶在脱氧核苷酸链 上
17、添加单个 脱氧 核苷酸 形成磷酸二酯键 DNA 复制、PCR 技术RNA 聚合酶在核糖核苷酸链 上 添加单个 核糖 核苷酸 形成磷酸二酯键 转录、RNA复制与 DNA 技术有关的酶的比较酶的名称作用化学键生理过程或应用解旋酶使碱基间氢键断裂形成脱氧核苷酸单链破坏氢键DNA 复制及转录逆转录酶以 RNA 为模板合 成 DNA形成磷酸二酯键逆转录、基因工程（续表）(1)DNA 连接酶连接两个DNA 片段，而DNA 聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。(2)限制性核酸内切酶的作用是识别、切割某种特定的脱氧核苷酸序列，使两条链在特定的位置断开，而解旋酶是将连接DNA 的两条链的氢键打开形成
18、单链。(3)基因工程中目的基因的获取和质粒的切割都由相同的限制性核酸内切酶切割。(4)DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、逆转录酶分别以DNA 单链 或 RNA 单链为模板，形成磷酸二酯键；而DNA 连接酶不需要模板。(5)上述酶的化学本质都是蛋白质。考向预测1.(2018年北京卷)用 Xho和 Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一 DNA 片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()图 1 酶切位点图图 2电泳结果示意图A.图 1 中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图 2 中酶切产物可用于构建重组 DNAC.泳道中是用 Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的 DNA 片段是单链
19、 DNA解析：通过图 1 可知，两种限制性核酸内切酶切割 DNA分子的不同部位，说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同，A 正确；图 2 中的酶切产物是DNA 分子片段，可用于 构建重组 DNA，B 正确；观察图 1 可知，该DNA 片段有3 个Sal酶切位点，故用Sal处理后，可形成4 个DNA 分子片段，电泳后出现4 条电泳带，C 正确；限制性核酸内切酶作用的是 双链DNA 片段，因此图中被酶切的DNA 片段应是双链DNA，D 错误。答案：D2.将某病毒的外壳蛋白(L1)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因连接，构建 L1GFP 融合基因，再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中
20、限制酶 E1 至 E4 处理产生的黏性末端均不相同。下列叙述不正确的是()A.构建 L1GFP 融合基因需要用到 E1、E2、E4 三种酶B.E1、E4 双酶切确保 L1GFP 融合基因与载体的正确连接C.GFP 可用于检测受体细胞中目的基因是否表达D.将表达载体转入乳腺细胞培育乳汁中含 L1 蛋白的转基因羊解析：构建 L1GFP 融合基因需要先用内切酶处理获得 L1 基因和 GFP 基因，并将二者连接，故需要用到 E1、E2、E4三种酶，A 正确；图中限制酶 E1 至 E4 处理产生的黏性末端均不相同，E1、E4 双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因 自身连接，保证 L1GFP 融合基因
21、与载体准确连接，B 正确；绿色荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，C 正确；为了获得L1 蛋白，可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞，用于培 育乳汁中含有 L1 蛋白的转基因羊，D 错误。答案：D考向2基因工程的原理及工具典例2(2018 年海南卷)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜_(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_。(2)若在转基因黄瓜中检测到
22、这种甜蛋白，则表明该重组质粒中_已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为 11，则说明甜蛋白基因已经整合到_(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用_作为外植体进行组织培养。(4)通常，基因工程操作主要有 4 个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为_。解析(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养
23、，理由是叶片伤口处的细胞会释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜 蛋白个体数之比为 11，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。(4)通常，基因工程操作主要有 4 个步骤，即目的 基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为按照 人们的
24、愿望进行设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。答案(1)受伤的叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞(2)甜蛋白基因核基因组(3)茎尖(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型考向预测3.(2018 年四川泸州模拟)转基因抗病香蕉的培育过程如图1 所示，图 2 表示 Pst、Sma、EcoR和 Apa四种限制酶的识别序列及酶切位点。请据图回答下列问题：图 1图 2(1)图中限制酶切割 DNA 时破坏的是两个_之间的化学键。(2)在构建图 1
25、中的重组质粒时要保证目的基因被连接在质粒上特定的_和终止子之间才能保证目的基因在受体细胞中被成功_。(3)将抗病基因从含抗病基因的 DNA 中切割下来，使用的限制酶是_，同时也应该用相同的酶对质粒进行切割，这样处理的原因是_。请写出单独用 Pst切割质粒后的片段：_。(4)转基因抗病香蕉的培育是否发生了 可 遗 传 变 异？_。药物 A 会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，根据这一原理可以利用含药物 A 的培养基筛选已导入重组质粒的香蕉细胞。由此推断，重组质粒中应含有_基因作为标记基因。解析：(1)限制酶切割DNA 时，破坏的是DNA 中特定的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)为了保证目的基
26、因在受体细胞中被成功表达(或转录)，在构建目的基因表达载体时，目的基因的上游和下游必须连接有恰当的启动子和终止子。(3)限制酶Sma的切割位点正好位于目的基因中间，如果用该限制酶切割会破坏目的基因，因此将抗病基因从含抗病基因的DNA 中切割下来，使用的限制酶只能是Pst和EcoR。为了能使切割下来的抗病基因与被限制酶切割开来的质粒正常连接，则切割质粒的限制酶也要使用这两种限制酶，因为用相同的限制酶切割质粒才能产生与目的基因相同的末端。根据图 2中的 Pst识别的碱基序列及切割位点可知，该酶切割质粒后得到的黏性末端是CTGCAG和GACGTC。(4)转基因抗病香蕉的培育是发生了可遗传变异，因为该
27、转基因香蕉与原香蕉的遗传物质相比，增加了抗病基因，其实质是基因重组。结合题意“药物 A 会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长”，如果导入 受体细胞内的重组质粒含有抗药物 A 的标记基因，则凡是能抗 药物 A 的受体细胞则能形成正常的愈伤组织，说明目的基因导入成功。答案：(1)脱氧(核糖)核苷酸(2)启动子转录(或表达)(3)Pst和 EcoR用相同的酶切割质粒才能产生与目的基因相同的末端，便于二者进行拼接CTGCAG和GACGTC(4)是抗药物 A考向3基因工程的基本操作程序典例3(2018 年新课标卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重
28、组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过 Ca2参与的_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体 DNA 通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体 DNA 导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。解析(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证
29、明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外 重组的质粒可通过Ca2处理，目的是以增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA 通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵 染的方法将重组噬菌体 DNA 导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内 表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白 酶活性
30、的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋 白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中 应添加蛋白酶的抑制剂。答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶考向预测4.(2019 年江苏卷)图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒 P0 具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：图 1图 2(1)EcoR V 酶切位点为GATATCCTATAG，EcoR V 酶切出来的线性载体 P1 为_末端。(2)用 Taq DNA 聚合酶进行 PC
31、R 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_的脱氧核苷酸，形成 P2；P2和目的基因片段在_酶作用下，形成重组质粒 P3。平板类型ABC无抗生素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素(3)为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如下表(“”代表生长，“”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是_(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_、_。(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙
32、、丙3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是_。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了 400bp 片段，原因是_。解析：(1)根据题意分析，EcoR V 酶识别的序列是 GATATC，并且两条链都在中间的T 与A 之间进行切割，因 此其切出来的线性载体 P1 为平末端。(2)据图分析，目的基因 两侧为黏性末端，且漏出的碱基为 A，则在载体 P1 的两端需要 加一个碱基 T 形成具有黏性末端的载体 P2，再用 DNA 连接酶 将 P2 与目的基因连接起来形成重组质粒 P3。(3)根据以上分析 可知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨
33、苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒 P3 的菌落在四环素中应 该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分 析可知，应该选择 B 类菌落。根据表格分析，A 类菌落在氨苄 青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是 P0；C 类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。(4)据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR 技术的原理分析，PCR 鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从 某一菌落的质粒中扩增出了400bp 的片段，说明其目的基因发生了反向连接。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA 连接(3)B
34、 A 类菌落含有 P0C 类菌落未转入质粒(4)乙、丙目的基因反向连接考向4基因工程的应用典例4(2018 年新课标卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在 GFP 基因的 5末端，获得了 L1GFP 融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒 P0，构建了真核表达载体 P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中 E1E4 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒 P0 时，使用了两种限制酶，这两种酶是_，使用这两种酶进行酶切是为了保证_，也是为
35、了保证_。(2)将 P1 转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_移入牛的_中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用 PCR 方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_(填“mRNA”“总 RNA”或“核 DNA”)作为PCR 模板。解析(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP 基因的5末端而获得的L1
36、GFP 融合基因，分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0 时，如果用E2 或 E3，则目的基因不完整，而使用E1 和E4 这两种 限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确 连接，因此，使用的两种限制酶是E1 和 E4。(2)构建的真核表 达载体P1 中含有GFP 基因，而GFP 基因的表达产物在紫外光 或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1 的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明 L1 基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养
37、成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。(4)PCR 是多 聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定 DNA 片段 的核酸合成技术。若利用 PCR 方法检测甲是否存在于克隆牛的 不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核 DNA作为 PCR 模板。答案(1)E1 和 E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核 去核卵母细胞(4)核 DNA基因工程操作过程中的四个注意点(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的 基因需限制酶剪切 2 次，共产生 4 个黏性末端或平末端，切割 质粒则只需限制酶剪切 1 次，因为质粒是环状 DNA 分子，而 目的基因在 DNA
38、分子链上。(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用 两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在 DNA 连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(4)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现 象：第一步存在于用逆转录法等获得 DNA 时，第二步存在于黏性末端连接时，第四步存在于检测分子水平杂交时。考向预测5.(不定项)B 基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究 B 基因表达对卵细胞的影响，设计并完成了如下实验来获取能够
39、在卵细胞中表达 B基因的转基因植株。下列关于该实验的叙述，正确的是()注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光A.B 基因在水稻卵细胞中不转录，可能是 B 基因的启动子在卵细胞中无法启动转录B.可利用水稻体细胞和精子中的 RNA 构建 cDNA 文库，从中获得 B 基因中编码蛋白的序列C.过程在培养基中应加入卡那霉素以检测 TDNA 是否整合到水稻细胞染色体 DNA 上D.在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光解析：启动子是与RNA 聚合酶结合并能起始mRNA 合成 的序列，所以B 基因在水稻卵细胞中不能转录
40、，可能是 B 基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A 正确；目的基因获取途 径之一就是从cDNA 文库中获得，B 正确；检测TDNA 是否 整合到水稻细胞染色体DNA 上，应该用DNA 分子杂交法，C错误；由于基因表达载体上有Luc 基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，D 正确。答案：ABD6.SRY-PCR 是对移植前的人胚胎进行性别鉴定的技术。基本操作程序如下：(1)从被测胚胎的_中取出几个细胞。(2)以 Y 染色体上 SRY 基因(性别决定基因)的一段序列作引物，用被测胚胎 DNA 作模板进行 PCR
41、扩增。根据 SRY 基因序列设计的引物长度一般为 2024 个核苷酸，其不宜过短的原因主要是_。两种引物中 GC 的含量相差不宜过大，原因主要是_。(3)最后可用放射性同位素标记的含有 SRY 基因的特异性DNA 序列作_，利用_技术检测扩增产物。如果某早期胚胎检测结果为阳性，则可判断该胚胎发育成的个体性别是_。若该技术岗位上的操作人员为男性，要求一定要戴好手套、口罩和工作帽等，主要原因是_。答案：(1)滋养层GC 的含量(2)防止引物随机结合(或引物的特异性差)差别过大，低温复性温度难以统一(3)探针DNA 分子杂交雄性男操作员的 SRY 基因可能污染样品考向5生物技术的安全性和伦理问题典例
42、5(2018 年河南信阳模拟)生物技术是一把双刃剑，既可以造福人类，也可能使用不当给人类带来灾难。请回答下列有关生物技术的安全性和伦理性问题：(1)由于科学发展水平的限制，在转基因生物中，有时候会出现一些人们意想不到的后果，引发了人们在食物安全、生物安全和_安全三个方面发生了激烈的争论。(2)在转基因生物或产品研究过程中，绝大多数科学家都能自觉遵守科学研究道德。如对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的_。(3)为解决不孕夫妇的生育问题而出现了试管婴儿技术，而2002 年，英国一对夫妇通过设计试管婴儿，利用新生儿脐带血中造血干细胞，挽救患地中海贫血症的男孩。这两项技术的区别是
43、_不需要经过基因检测。解析(1)转基因生物的安全性在以下三个问题方面存在争议：食物安全(滞后效应、过敏源、营养成分改变)、生物安全(对生物多样性的影响)、环境安全(对生态系统稳定性的影响)；(2)在转基因生物或产品研究过程中，需对外源 DNA 进行认真选择，避免产生对人体有毒性或过敏的蛋白质；(3)设计试管婴儿技术是通过体外受精获得许多胚胎，然后从中选择符合要求的胚胎，再经移植后产生后代的技术。答案(1)环境(2)蛋白质(3)试管婴儿技术考向预测7.生物技术的迅猛发展挑战了原有的社会伦理道德秩序，引起了激烈的争论。(1)支持者认为，克隆人是一项科学研究，应当有它内在的发展规律，允许有一定的发展
44、。反对者则认为，克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念，克隆人是在人为地制造_都不健全的人。(2)在针对克隆技术的争论中，我国政府态度明确，及时立法，规范了克隆技术的应用。我国明确禁止生殖性克隆人，一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、_任何生殖性克隆人的实验。(3)设计试管婴儿与试管婴儿在技术手段上的区别是_，前者的生殖方式上是_。答案：(1)心理上和社会地位上(2)不接受(3)多了胚胎移植前进行遗传诊断这一环节有性生殖考向6蛋白质工程典例6(2018年天津卷)甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017 年发明了一种制备该病毒活疫苗的新
45、方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_进行分子杂
46、交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊 tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是_(单选)。A.病毒的 DNA 聚合酶C.病毒的 RNA 聚合酶B.宿主的 DNA 聚合酶D.宿主的 RNA 聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起_免疫，增强免
47、疫保护效果。解析(1)体外进行 DNA 扩增采用的技术手段是多聚酶链 式反应(PCR 技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术鉴定，筛选获得成功 表达目的RNA 的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没 有 Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基 中
48、加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA 聚合酶，因为转 录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA 聚合酶。(4)不具有侵染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。答案(1)PCR 多肽(或蛋白质)(2)载体 总 RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D (4)细胞考向预测8.(2019 年黑龙江大庆质检)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子-肽链第 6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原
49、因是编码血红蛋白基因的_序列发生改变。(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作_(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作_。(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_，以其作为模板，在_酶的作用下反(逆)转录合成 cDNA。cDNA 与载体需在限制酶和_酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_，用相应的抗体进行_杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。解析：(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造，因此不属于蛋白质工程。(3)因血红蛋 白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，反(逆)转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA 连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原抗体杂交实验加以判断。答案：(1)碱基对(或脱氧核苷酸)没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因(2)不属于进行修饰)(3)mRNA(或 RNA)逆转录 DNA 连接(4)蛋白质抗原抗体
