1、第2课时微生物的接种、分离、纯化与计数课标内容要求核心素养对接1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。3.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。生命观念：各类微生物都能适应其生活环境。科学思维：根据微生物特点及要求正确选择微生物接种、分离与计数的方法。科学探究：探究土壤中尿素分解菌的分离方法并进行计数。一、微生物接种和传代的无菌技术1菌种的保存(1)保存条件：低温、干燥、真空。(2)原理：在人工创造的条件下，降低细胞的代谢水平，使细胞基本处于休眠状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又
2、不至于死亡。2接种方法：穿刺接种(适用于厌氧菌)和斜面接种(常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法)。实例斜面接种和培养酵母菌准备接种(点燃酒精灯，取两支盛有培养基的试管，其中一支内有菌种，另一支为无菌的斜面培养基，用一只手的拇指和其他四指夹住试管，使管口齐平，管内培养基斜面向上)接种环灭菌(手持接种环，将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次)试管口灭菌(在火焰附近用握有接种环的手的小拇指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，迅速将试管口通过火焰23次，以杀灭试管口上的微生物)挑取菌体(待灭菌后的接种环冷却后轻轻挑取少许菌体，抽出接种环时，注意带菌部位不要触
3、及管壁或通过火焰)接种(迅速将上述带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，注意不要将培养基的表面划破)培养(将试管口与试管塞分别通过火焰23次，迅速塞紧试管。将接种过菌种的试管放在恒温箱中培养24 h，观察接种和培养的结果)3菌种的传代和保存：先挑选典型菌落，再接种在斜面培养基上，按规定的温度和时间培养；待充分生长后，将培养好的装有新鲜菌种的试管用牛皮纸包扎好，置于4_左右的冰箱中保藏，以减缓培养基的水分蒸发，延长保存时间。通常每隔23个月重新接种一次，再继续保存。二、微生物分离、纯化和培养的无菌技术1平板划线法分离和纯化微生物(1)平板划线法：把含有多种微
4、生物的杂菌样品，通过在特定的琼脂平板表面划线稀释，从而获得单个菌落的方法。(2)纯化微生物：由单个微生物增殖形成的菌落，就是这种微生物的纯种菌落。(3)平板划线法的操作平板划线法分离和培养酵母菌菌落示意图2稀释涂布平板法分离和纯化微生物(1)稀释涂布平板法：将待分离的材料做一系列的梯度稀释，再取一定量的某一稀释度的菌液涂布平板，然后用无菌的涂布器将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使其中的微生物充分分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。(2)用途：可用于菌种的分离和纯化以及微生物计数。(3)涂布平板操作系列梯度稀释：将待分离的材料进行10倍系列梯度稀释取菌液：取一定稀释度的菌液，滴加到培养基
5、表面涂布器涂布：用灭过菌的涂布器均匀涂布观察菌落3混合平板法分离和纯化微生物(1)操作：将稀释的少量菌悬液与50 左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养。(2)结果：培养基表面和内部均可长出单个菌落。4分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数(1)实验原理通过提供要研究的微生物增殖生长的必需条件，或加入某些抑制剂抑制其他微生物的增殖生长，可分离和纯化所需的微生物。在高度稀释的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成单个菌落。单个菌落即为纯化培养物，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。(2)实验步骤选取土壤(取土壤10 g，放入灭菌的信封中备用)制备土壤悬液(
6、称取1 g土壤样品，梯度稀释，依次制备质量浓度为105gmL1、106gmL1、107gmL1、108gmL1的土壤悬液)配制培养基及制作平板(溶解调pH灭菌冷却倒平板)涂布(每个浓度设置3个重复，在平板上涂布均匀)培养与观察(培养皿倒置于37 恒温箱中培养12 d，每24_h观察一次)计数菌落(选取菌落数为30300的一组为样本进行统计。每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数涂布所用稀释液体积数)提醒：微生物培养物不可随意丢弃，应对其进行灭菌处理后置于回收桶中，以免造成环境污染。判断对错(正确的打“”，错误的打“”)1在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养
7、皿盖。()提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。2平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。()答案3稀释涂布平板法和平板划线法均能计数。()提示：平板划线法不能计数。4平板划线操作中，划完一个区域后要将接种环灼烧，再划下一个区域。()答案5统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。()提示：由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。6用平板划线法培养计数，应选择菌落数在10100的平板。()提示：微生物计数采用稀释涂布平板法，为保证结果准确，应选择菌落数在30300的平板。7分解尿素的细菌在分解尿素时，
8、可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。()提示：尿素分解菌将尿素转化为氨，使得培养基的pH升高。微生物的纯培养1平板划线法平板划线操作及培养结果：接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。平板划线示意图及培养后菌落分布示意图如下图A、B所示。2稀释涂布平板法(1)主要操作环节：系列稀释和涂布平板。(2)系列稀释和涂布平板后培养结果如图所示：3平板划线法与稀释涂布平板法的注意事项(1)平板划线法接种环的灼烧a第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。b每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。c划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染
9、操作者。灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种。划线时最后一区域不要与第一区域相连。划线用力要大小适当，防止用力过大划破培养基。(2)稀释涂布平板法稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处。涂布平板时：a涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。b不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。c酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。4两种纯化细菌方法的比较项目优点缺点平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数稀释
10、涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较小，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延合作探究：(1)倒平板时，培养基冷凝后，为什么要将平板倒置？提示：培养基冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。(2)接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？提示：划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。(3)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果有菌
11、落生长，说明了什么？提示：培养未接种培养基的作用是做对照。未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。1下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是()A步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行B步骤中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖C步骤中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理D划线接种结束后，将图平板倒置后放入培养箱中培养B由图可知，是倒平板，是用接种环蘸取菌液，是进行平板划线，是培养。步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A正确；倒完平板后应立即盖上培养皿，
12、冷却后将平板倒过来放置，B错误；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C正确；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，可以避免培养基中的水分过快地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D正确。2下图甲、乙是微生物接种常用的两种方式，回答相关问题：(1)图甲是利用_法进行微生物接种的，图乙是利用_法进行微生物接种的。这两种方法所用的接种工具分别是_和_；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是_和酒精消毒。(2)平板划线时，为保证微
13、生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从_开始，平板划线结束后，最后一次划线不能与第一次划线_。(3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？_。(4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是_(填“图甲”或“图乙”)所示方法。(5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？_。解析(1)图甲和图乙分别是利用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物接种的，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器；对两种接种工具进行灭菌和消毒的方法分别是灼烧灭菌和酒精消毒。(2)平板划线时，每次划线前都要从上一次划线的末端开始，最后一次划线不能与第一次划线相连。
14、(3)在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。(4)培养基上的菌落分布均匀，接种方法为稀释涂布平板法。(5)采用稀释涂布平板法进行菌种分离时，稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。答案(1)平板划线稀释涂布平板接种环涂布器灼烧灭菌(2)上一次划线的末端相连(或相接、相交、交叉等)(3)酒精灯火焰附近存在无菌区域(4)图乙(5)稀释倍数不够，菌液的浓度太高单细胞菌落的获得(1)利用平板划线法接种时，单细胞菌落从后划线的区域挑取。(2)利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落。微生物计数的方法微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但
15、是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：项目直接计数法间接计数法原理利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌主要用具显微镜、细菌计数板培养基计数数据菌体本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，有一定误差计算公式每毫升原液含菌数每小格平均菌体数40010 000稀释倍数每毫升原液含菌数培养基上平均菌落数稀释倍数涂布液体积合作探究：(1)在用稀释
16、涂布平板法对微生物进行计数时，统计菌落数目的理论依据是什么？提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。(2)在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。(3)为什么一般选择菌落数为30300的平板进行计数？提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。(4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？提示：尽量缩小统计的菌落数与实际
17、活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。(5)稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。1用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A涂布了1个平板，统计的菌落数是230B涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值16
18、3D涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234D在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。2下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是()A3号试管的稀释倍数为103倍B4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍C5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7109个D该实验方法统计得到的结果往
19、往会比实际活菌数目要多C3号试管的稀释倍数为104倍，A项错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B项错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168175167)30.11061.7109(个)，C项正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，得到的结果往往会比实际活菌数目少，D项错误。用稀释涂布平板法计数微生物的方法(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30300的平板(相同稀释度的平板均
20、符合该特点)进行计数，然后取平均值。(4)每克样品中的菌株数某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积稀释倍数。课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 背 诵1.低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物生长和代谢的作用，因此低温、干燥、真空是菌种保存的重要条件。2.平板划线法是指把含有多种微生物的杂菌样品，通过在特定的琼脂平板表面划线稀释，从而获得单个菌落的方法。由单个微生物增殖形成的菌落，就是这种微生物的纯种菌落。3.稀释涂布平板法是将待分离的材料做一系列的梯度稀释，再取一定量的某一稀释度的菌液涂布平板，然后用无菌的涂布器将菌液均匀地涂布在整个平板表面，使
21、其中的微生物充分分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。4.稀释涂布平板法不仅可以用于菌种的分离和纯化，还可以用于微生物计数。5.将稀释的少量菌悬液与50 左右的培养基混合均匀后倒入无菌培养皿中，再将培养皿置于合适温度下培养。在培养基表面和内部均可长出单个菌落。6.通过提供微生物增殖生长的必需条件，或加入某些抑制剂抑制其他微生物的增殖生长，可分离和纯化所需微生物。在高度稀释的条件下，于固体培养基上培养该微生物形成单个菌落，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。1在接种操作的过程中，不正确的是()A要将接种环灼烧灭菌B取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C将接种环伸入试管内，先接触长菌多的
22、部位D接种后还要将管口灭菌加塞C接种环伸入试管内，先接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位，待接种环冷却后再接触长菌部位。2下列有关平板划线操作的描述，错误的是()A将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红B接种环在平板上划线的位置是随机的C在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰D最后一区的划线不能与第一区相连B接种环在平板上划线的位置并不是随机的，将蘸有菌种的接种环伸入平板内，划三至五条平行线后应盖上皿盖，并灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线，重复以上操作，在三、四、五区域内划线。3下列有关稀释涂布平板法操作的叙述，不正确的是()A若稀释梯度
23、以10倍为单位，当用移液管取1 mL原始菌液进行稀释时，其余试管内的无菌水应为9 mLB每次用灭菌后的移液管取菌液前，要先将菌液混匀C在涂布过程中，每次变换涂布的方向和位置时，应对涂布器进行灼烧灭菌D将菌液涂布在培养基表面时，为使涂布均匀，应及时转动培养皿C在涂布前，应将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，用涂布器将菌液均匀涂布在培养基的表面，涂布结束后，应对涂布器进行灼烧灭菌，以防污染环境和感染操作者，C错误。4下列有关微生物培养的叙述正确的是()A纯化培养时，对培养皿皿盖做标记，培养皿应正放于恒温培养箱内进行培养B培养基采用高压蒸汽灭菌法灭菌，高压灭菌加热结束后，可直接开启锅盖C
24、涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用D可用平板划线操作对微生物进行分离和计数C纯化培养时，培养皿应倒置放在恒温培养箱内进行培养，A错误；培养基采用高压蒸汽灭菌法灭菌，高压灭菌加热结束后，要等压力回零后才可开启锅盖，B错误；涂布接种时，需将涂布器蘸酒精后在酒精灯外焰上引燃，冷却后再使用，C正确；平板划线操作可对微生物进行分离，但不能对微生物进行计数，D错误。5下表是培养某微生物的培养基的配方，请回答下列问题：组分牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水用量5 g10 g5 g20 g1 000 mL(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、_和无机盐。上述培养基配方中能充
25、当碳源的成分是_。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行_处理。(2)在配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行_(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需进行清洗和_；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质_，还能损伤DNA的结构。(4)分离纯化微生物最常使用的接种方法是_和_。(5)在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。解析(1)培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。培养基配制完成后要调pH和灭菌。牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。(
26、2)配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(3)灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，所以要对培养基和培养皿进行灭菌。消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，故操作者的双手需要进行清洗和消毒。紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。(4)分离纯化微生物常采用平板划线法和稀释涂布平板法。(5)培养微生物时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。答案(1)氮源牛肉膏和蛋白胨灭菌(2)温度酸碱度(3)灭菌消毒变性(4)平板划线法稀释涂布平板法(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生