1、考点1微生物的分离和培养1理清培养基制备与微生物纯化技术(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物学实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。(2)观察菌落需用固体培养基，因此培养基要添加琼脂。(3)倒平板的温度一般在50 左右，温度过高会烫手，温度过低培养基会凝固。(4)平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又能防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。(5)平板划线法只适用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。(6)利用稀释涂布平板法估算水样中的活菌数的计算公式：(CV)M(稀
2、释倍数)。(7)菌种可用甘油管藏法长期保存，保存时菌液中常添加一定量的甘油。2微生物分离与计数的两个实例(1)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数筛选菌株：利用以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选菌株。测定微生物数量的常用方法：活菌计数法和显微镜直接计数法。过程：土壤取样样品稀释微生物的培养与观察。鉴定方法：含酚红指示剂的以尿素为唯一氮源的培养基细菌指示剂变红，则该菌能分解尿素。(2)分解纤维素的微生物的分离实验原理：即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。流程：土壤取样选择培养梯度稀释涂布平板挑选菌落。1(2018全国，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中
3、加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下
4、结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_。答案(1)细菌选择(2)碳源、无机盐蛋白质、核酸(3)碘液淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差解析(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋
5、白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解成麦芽糖，淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30300个的平板，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中， 1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。方法技巧选择培养基作用原理的判断(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的“加入”是
6、在主要营养成分完备的基础上进行的。(2)改变培养基中的营养成分。缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；以石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。2(2018全国，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前
7、，适量喷洒_，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过_(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_。答案(1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽解析(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160170 条件下加热12 h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在7075 条件下煮30 min或在80 条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生
8、物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。模型构建三种常用灭菌方法的比较灭菌方法灭菌条件灭菌时间适用材料或用具灼烧灭菌酒精灯火焰的充分燃烧层直至烧红接种环、接种针或其他金属工具干热灭菌干热灭菌箱内，160170 12 h玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等
9、高压蒸汽灭菌100 kPa,121 1530 min培养基等3.(2016全国，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为3
10、6个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。若将30(即366)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_(填“正确”或“不正确”)。答案(1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染不正确解析(1)牛肉膏和蛋白胨都可以作为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内“不同高度空气”中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白
11、对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。方法技巧关注两种对照组与一种重复组(1)将未接种的选择培养基与接种的选择培养基一起培养用于确认培养基灭菌是否彻底(制备是否合格)。(2)将接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养用于确认选择培养基是否起到“筛选”作用。(3)进行微生物计数时，每一稀释度下涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数准确度。4(2018保山第二次统测)李斯特菌广泛存在于各类食品中，李斯特菌在李斯特菌显色培养基上培育时菌落会呈现蓝绿色。在目前发现的16种李斯特菌中单增李斯特菌是唯一对人有致病性的一种，与其他
12、李斯特菌相比，单增李斯特菌还能合成并分泌磷脂水解酶，使培养基中的磷脂被分解而在单增李斯特菌菌落周围出现白色晕环。(1)与单增李斯特菌相比，其他李斯特菌不能合成并分泌磷脂水解酶的原因是_。(2)现要检测某食品中是否含有其他李斯特菌和单增李斯特菌，进行下列相关实验：将该食品样品加入经_灭菌的李斯特菌选择培养液中培养，培养的目的是_。将经过培养的菌液用_进行系列梯度稀释后，利用_法接种到鉴定李斯特菌的培养基上。鉴定李斯特菌的培养基与李斯特菌选择培养液相比，还需额外添加显色剂、_和_。将接种后的培养基置于适宜条件下进行培养。一段时间后若培养基上出现_的菌落，则说明该食品中含有单增李斯特菌。答案(1)其
13、他李斯特菌不含有控制磷脂水解酶合成的基因(2)高压蒸汽增加李斯特菌的浓度，确保能从样品中分离到所需微生物无菌水稀释涂布平板磷脂琼脂蓝绿色且周围有白色晕环解析(1)根据以上分析可知，单增李斯特菌具有磷脂水解酶基因，而其他李斯特菌不含有控制磷脂水解酶合成的基因，因此其他李斯特菌不能合成并分泌磷脂水解酶。(2)将该食品样品加入经高压蒸汽灭菌的李斯特菌选择培养液中培养，以增加李斯特菌的浓度，确保能从样品中分离到所需微生物。将经过培养的菌液用无菌水进行系列稀释后，利用稀释涂布平板法接种到鉴定李斯特菌的培养基上。鉴定李斯特菌的培养基与李斯特菌选择培养液相比，还需额外添加显色剂、磷脂和琼脂。若该食品中含有单
14、增李斯特菌，则一段时间后，培养基上会出现蓝绿色且周围有白色晕环的菌落。5(2018太原高三模拟)反刍动物如牛和山羊，具有特殊的器官瘤胃，瘤胃中生活着多种微生物，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究，请回答下列问题：(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是_(多选)。A酒精灯 B培养皿 C显微镜 D无菌水 E接种环(2)向试管内分装含琼脂的培养基时 , 若试管口粘附有培养基 , 需要用酒精棉球擦净的原因是_。(3)刚果红可与_形成红色复合物，研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落(见图 1)。图中降解圈大小与纤维素酶的_有关。图中
15、降解纤维素能力最强的菌株是_(填图中序号)。(4)纤维素酶高产菌株在20 长期保存时，菌液中常需加入一定量的_保藏。(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株 A 和 B，在不同温度和 pH 条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图 2，推测菌株_更适合用于人工瘤胃发酵，理由是_。答案(1)CE(2)避免培养基污染棉塞(3)纤维素量与活性菌2(4)甘油(5)B发酵过程会产热和产酸，B 菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高解析(1)在样品稀释中需要使用无菌水稀释；在涂布平板操作中，需要使用酒精灯对涂布器进行灭菌，并在酒精灯火焰旁完成对培养皿涂布接种操作，所以从选项分析可知，显微镜和接种环不需
16、要，故选CE。(2)分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净以避免培养基污染棉塞。(3)根据“刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌”，所以在刚果红培养基平板上，可以筛选到有透明降解圈的菌落，降解圈大小与纤维素酶的量和活性有关。纤维素酶的量越多，活性越强，分解的纤维素越多，透明降解圈越大，所以图中降解纤维素能力最强的菌株是菌2。(4)在20 长期保存菌株时，菌液中常需加入一定量的甘油保藏。(5)由于胃部pH值较低，根据题意和图示分析可知，发酵过程会产热和
17、产酸，B菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，所以推测菌株B更适合用于人工瘤胃发酵。6.(2018新乡高三第二次模拟)回答下列与微生物的培养与应用有关的问题：(1)微生物的培养需要使用培养基，不同培养基的配方不同，但一般都具有_。在配制从土壤中筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入_作为唯一的碳源。(2)下图中产生每个菌落的最初细菌数为_个才是最理想的。据图分析，在培养基上划线接种时，划线的顺序依次是_(用编号和箭头表示)。(3)根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大概推测出样品中的活菌数。某同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为25.6，则每毫升
18、样品中的活菌数是_个(所用稀释液的体积为0.2 mL)。(4)若要鉴别纤维素分解菌，可用_法；若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入_。答案(1)碳源、氮源、水和无机盐纤维素(2)1(3)1.28106(4)刚果红染色酚红指示剂解析(1)培养微生物的不同培养基，虽然其配方不同，但一般都具有碳源、氮源、水和无机盐。在配制从土壤中筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入纤维素作为唯一的碳源。(2)图示中产生每个菌落的最初细菌数为1个才是最理想的。采用平板划线接种时，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线后，就可以得到单菌落，据此分析图示可知：划线的顺序依次是。(3)所用稀释液的体积为0.2 mL，在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为25.6，则每毫升样品中的活菌数是25.61040.21.28106(个)。(4)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应，因此若要鉴别纤维素分解菌，可用刚果红染色法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入酚红指示剂。