1、1.2 基因工程的基本操作程序 1目的基因的获取 2基因表达载体的构建 3将目的基因导入受体细胞 4目的基因的检测与鉴定 基因工程基本操作的四个步骤 目的基因的获取 阅读课本第一自然段，回答以下问题：2获取目的基因的常用方法有哪些？（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成 1什么叫目的基因？并举例说明。主要是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子1原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端是RNA聚合酶识别和结合的部位并能驱动基因转录出mRNA。没有启动子，基因就不能转
2、录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 2真核细胞的基因结构 注意：原核基因转录出的mRNA只能与编码区的 链配对，与编码区中互补链呢？真核基因转录出的mRNA只能与编码区的 配对。（一）从基因文库中获取目的基因1.基因文库：概念见课本2.基因文库的分类:（按外源DNA片段的来源分类）种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.建立基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基
3、因。提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 4.基因文库的构建方法（1）基因组文库构建 单链互补DNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与载体连接 cDNA文库 反（逆）转录酶DNA聚合酶（2）cDNA文库的构建反转录法 某种生物的单链mRNA 思考：1基因组文库和cDNA文库的比较 2如何从基因文库中得到所需要的目的基因？(见课本P9)文库类型cDNA文库 基因组文库文库大小基因中启动子有无基因中内含子有无基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以阅读课本第10页
4、回答问题：（1）RCR 的中文全称？PCR是一项什么样的技术？（2）PCR原理？利用这一技术获取目的基因的前提？（3）PCR的过程？这一过程利用了什么酶？（4）通过PCR使目的基因的数目如何增长？(三)利用PCR技术扩增目的基因 5/3/GG TC 3/5/AG CC 5/3/引物 GG 变性 复性 延伸 1变性(9095)：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2复性（5560 ）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3延伸（7075 ）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链 5/3/AG 引物 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的
5、核酸合成技术 条件：原理：方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）结果：聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 双链DNA复制 四种原料 热稳定DNA聚合酶（Taq酶）指数 2n 在短时间内大量扩增目的基因 前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列2种引物、模板DNA（含目的基因）蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成工具：DNA合成仪条件：基因比较小，核苷酸序列已知思路流程：（二）人工直接合成目的基因小结目的基因的获取目的基因的定义常用方法从基因文库中获取利用PCR技术扩增 人工合成基因组文库部分基因文库原理、条件方式、结果过程二、基因表达载体
6、的构建 核心 1基因表达载体构建的目的？（见课本P11）2基因表达载体的组成？3启动子、终止子、标记基因的作用分别是？4如何构建基因表达载体？读教材回答以下问题 基因表达载体的组成及各部分作用目的基因作用：终止转录标记基因：鉴别并选择含目的基因的细胞作用：启动转录1.用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端平末端。2.一般用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端平末端。3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）。如何构建基因表达载体？通读教材回答问题1转化的概念2将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别
7、有哪些？三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞常用的转化方法有：按不同的受体细胞分 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 1将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。过程：将外源目的基因插入Ti质粒的T-DNA中形成重组Ti质粒 将重组Ti质粒转入农杆菌 使含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞 含目的基因的植物细胞表现出新性
8、状的植株（2）基因枪法 （3）花粉管通道法 2将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物 3将目的基因导入微生物细胞 阅读课本：早期基因工程为何选择原核生物作为受体细胞？方法？原核生物特点：单细胞繁殖快、遗传物质少方法：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定 阅读课本:目的基因检测的过程分为哪几步？分别用什么方法？鉴定（个体生物学水平）方法？四、目的基因的检测与鉴定1、分子水平的检测2.个体生物学水平的鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质方法是：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴
9、定等检查目的基因是否成功表达检测目的基因是否转录出了mRNA方法是：检测转基因生物的DNA 上是否插入了目的基因方法是：DNA分子杂交（DNARNA）分子杂交抗原抗体分子杂交DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。过程:A首先提取出转基因生物的DNA。B对含目的基因的DNA片段作放射性同位素标记，以此做基因探针。C用基因探针和提取的转基因生物的DNA杂交。若显示出杂交带，表明转基因生物的DNA中已插入目的基因；反之，则没有
10、插入。DNA分子杂交鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。思考：若培育耐盐碱的水稻，如何鉴定？归纳：基因工程的基本操作程序1.获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 2.构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 4.目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：学以致用 若用Bt毒蛋白基因作为目的基因培育转基因抗虫棉，可用什么方法？叙述培育过程！练习：(2008理综山东
11、卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）aa（）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技术的核心是和。（）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养脱分化和再分化耐盐基因一定浓度盐水浇灌练习：继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入 中，原因 （3）通常采用_技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_细胞中特异表达。显微注射受精卵受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因DNA分子杂交膀胱上皮（或早期胚胎）在相应的组织细胞中表达。