1、课题2：多聚酶链式反应扩增DNA片段教学目标：（一）知识与技能1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用（二）过程与方法在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件（三）情感、态度与价值观通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作教学难点：PCR的原理教学过程：（一）引入回忆DNA作为生物界主要的遗传物质，具备哪些特点？（多样性碱基对排列顺序多种多样，携带大量遗传信息；稳定性双螺旋结构保持分子相对稳定）此外，DNA分子还需要通过复制，将遗传信息传递给子
2、代。并且DNA复制不仅可以在胞内发生，还可以在体外进行。让我们先来回忆DNA在胞内的复制过程。（二）进行新课1基础知识PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：学生观看DNA复制动画，思考并总结DNA复制所需条件和特点，对照学案上的表格进行填写。11 细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点12 细胞内DNA复制过程解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。引物结合
3、：在DNA单链3端与DNA反向配对结合，确保引物3端与DNA单链准确配对。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“53合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，
4、在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。思考DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。13 体外扩增DNA片段人们为什么要扩增DNA呢？在哪些领域需要对DNA进行扩增？（鉴定，基因工程等领域需要足量的DNA才可以操作）DNA体外复制和在胞内有什么区别和共同点呢？请看第二段视频：播放PCR原理动画并完成表格。解开螺旋：在80100时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶
5、,两种引物。反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。思考缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）PCR的反应过程延伸复性变性变性：在95时DNA解旋复性：在50时引物与DNA单链结合延伸：在72时合成DNA子链（两个引物间的序列）思考： a b 如何设计引物？ 5ACCTAGCCACGGCCTT3 3TGGATCGGTGCCGGAA5 c d2实验操作21 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水22 实验操作步骤23 按照PCR反应体系配方配制反应液；（2）将PCR反应体系50L用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；（3）将微量离
6、心管放到PCR仪中；（4）设置PCR仪的工作参数。（5）DNA在PCR仪中大量扩增。24 水浴法：将微型离心管依次在95、55、72的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3实验注意事项31避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。32缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。33每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。34混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。4结果分析与评价41反应液稀释：取2LPCR反应液，添加98L蒸馏水；2分光光度计调零：将100L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。42将100L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。43计算：DNA含量50光吸收值稀释倍数（三）课堂总结、点评多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算
