1、第2讲 酶母细胞的固定化【重难点突破】一、如何理解固定化酶的作用和原理？1酶的催化活性依赖于酶的空间结构及活性中心。所以在固定化要选择适当条件，力图不使其活性中心的基团受到影响。2酶固定化的方法很多，目前采用的固定化技术大致可分为三类：载体结合法(包括共价键结合法、离子结合法、物理吸附法)、交联法和包埋法。上述几种方法也可并用，称为混合法。(1)载体结合法：利用共价键、离子键和物理吸附法把酶固定在纤维素、琼脂糖、多孔玻璃和离子交换树脂等载体的固定化处。 (2)交联法：交联法是利用双功能试剂的作用，在酶分子之间发生交联，凝集成网状结构而制成的固定化酶。酶蛋白中的游离基团(如氨基、巯基等)可参与交
2、联反应。(3)包埋法：包埋法是将酶包埋在聚合物凝胶的微细网络中或被半透性的聚合物膜所包围，使酶分子不能从凝胶的网络中或膜中漏出，而小分子的底物和产物则可以自由通过凝胶网格和半透膜。3固定化酶应用实例将葡萄糖异化酶固定在果颗状载体上放入底部有许多小孔的反应柱(酶颗粒不能通过，反应液能通过)葡萄糖溶液从反应柱上端注入流经反应柱与葡萄糖异构酶接触果糖从反应柱下端流出。4.对固定化酶的理解：可以使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中回收；酶的稳定性有所改进；酶的使用效率提高。【典题演示1】1. (2010苏南四市一模)固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。科研人员用海藻酸钠作为包埋剂
3、来固定小麦酯酶，以研究固定化酶的相关性质和最佳固定条件。酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量。下图甲、乙、丙为部分研究结果。下列有关叙述中，错误的是A由甲图可知，固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强B由乙图可知，浓度为3%的海藻酸钠包埋效果最好C由丙图可知，固定化酯酶一般可重复使用3次，之后若继续使用则酶活力明显下降D固定化酶的酶活力较高，主要原因是增加了酶与底物的接触面积【答案】D【解析】正确掌握固定酶的特性和识别图形是突破口。甲图可以看出在50度时游离酶的活性已经很低，但是固定酶的活性依然很高，可以判定固定酶的温度适应范围广；乙图反应的时海藻酸钠的浓度与酶活力的关
4、系，可以看出浓度为3%时，酶活力最高；丙图可以看出使用三次以后酶活力明显下降；固定化酶与底物的基础面积减少。【变式训练1】1. 下列不属于固定化酶在利用时的特点的是 （ ） A有利于酶与产物分离 B可以被反复利用 C能自由出入依附的载体 D一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应【答案】C【解析】掌握固定酶的知识时突破口。固定酶是把酶固定在特殊材料上，不能自由出入依附的载体。【变式训练2】（09江苏高考生物）下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是（ ）A固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显B固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供
5、适宜的营养条件D利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物【答案】A【解析】本题对固定化酶和固定化细胞进行发散考查，固定化酶发挥作用，与溶解氧无关，B选项错；固定化酶不属于生物，不需要提供营养，而固定化细胞进行生命活动，是需要营养的，C选项错；糖类既是酵母菌作用的底物，也是微生物培养所需碳源。【变式训练3】、下列有关固定化技术的叙述，正确的是（ ）A固定化酶只是在细胞内才能发挥作用 B固定化酶能提高酶的利用率C酶的固定是酶分离纯化的常用方法 D固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上。【答案】B【解析】本题主要考查固定化酶的相关知识。考纲中的能力要求是A级。理解固定化技术的原理及优
6、点是本题的解题突破口。制成固定化酶的步骤是：酶的生产、提取、酶的分离纯化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固体表面，有将酶相互连接起来将酶包埋在细微的网格里等；这样的固定化酶能重复利用，从而提高了酶的利用率；而酶在条件适宜时，既可在细胞内起作用，也能在细胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在细胞外发挥作用。二 如何理解固定化细胞的作用和原理？1、固定化微生物细胞利用微生物来生产酶，具有生产成本低、周期短、产量大等优点。微生物产生的酶，可以分为分泌在细胞外的胞外酶和包含在细胞内的胞内酶。利用胞内酶时，需要采用手段将细胞破碎后，将酶进行分离纯化，提取后酶的活性和稳定性往往都受到很大的影响。将
7、微生物细胞限制或定位于特定空间位置，即将微生物制成固定化细胞后，既能避免复杂的细胞破碎、酶的提取和纯化过程，又能使酶的活性和稳定性得到较大提高。固定后的微生物细胞可以作为固体催化剂在多步酶促反应中发挥连续催化作用，同时，催化反应结束后又能被回收和重复利用。优点：制备容易、酶的活性高且稳定。2、固定化活细胞的制备主要方法：包埋法。将微生物细胞用物理方法包埋多微也载体内部。凝胶包埋是最常用的方法，凝胶种类有琼脂、海藻酸钠（钙）、角叉菜聚糖、明胶和聚丙烯酰胺凝胶。目前常用海藻酸钙包埋法，其基本原理是：先将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中(常用CaCl2溶液)，使海
8、藻酸钠中Na+的部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。这种方法操作简便，条件温和，对细胞无毒性，适合于生长细胞的固定化。但磷酸盐会使凝胶结构破坏，在使用时应控制好培养基中磷酸盐的浓度，并要在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。 3、比较直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点。类型优点不足直接使用酶催化效率高，低耗能，低污染对环境非常敏感，易失活；难回收，不能再次利用，与产物混在一起，可能影响产品质量固定化酶(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。(3)酶反
9、应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。(5)较能适应于多酶反应。(6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。(2)比较适应水溶性底物和小分子底物。(3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。 （4）一种酶只能催化一种化学反应，生产实践中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应得到的。固定化细胞(1)省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。(2)细胞生长快、而且多、反应快。(3)可以连续发酵，节
10、约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。【典题演示2】 1. 下列说法不正确的是 （ ） A葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成的是果糖 B从固定化酶反应柱下端流出的是果糖 C高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管疾病 D酶溶解于葡萄糖溶液后，可从糖浆中回收【答
11、案】D【解析】正确区别固定化酶与酶制剂是关键。葡萄糖异构酶催化葡萄糖转化为果糖；在反应柱上方流进葡萄糖溶液，下方流出果糖；果糖和蔗糖相比较具有很多优点；酶不会溶解在反应液中，因为它被固定在载体材料中。【变式训练4】 1.关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法错误的是 ( )A固定化酶生产活性强，可长久使用B一般酶制应用后和产物混在一起，产物的纯度不高C一般酶制剂参加反应后不能重复利用 D固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量【答案】A【解析】区分固定化酶与酶制剂是本题的解题突破口。该题主要考查了固定化酶的优点，即应用后易与产物分离，提高产品质量；可以反复利用，降低生产成本。但是
12、固定化酶作为生物催化剂，具有一定的生物活性。随着时间的推移，酶的活性会降低，甚至消失，即固定化酶不能长久使用。例如：生产高果糖浆的固定化酶一般只能连续使用半年。【变式训练5】试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ ） 【答案】D。【解析】本题主要考查酶固定和细胞固定的相关知识。考纲中的能力要求是A级。区分酶固定和细胞固定的方法是本题的解题突破口。解析过程：A是吸附法，常用于将酶固定；B是载体结合法多用于酶的固定；C和D是包埋法，C一般是将酶包埋在微网络里，D是包埋在凝胶中。制备固定化酵母用的是包埋法，即将酵母菌包埋在海藻酸钠制成的凝胶中，所以与D相似。三 制备固定化酵
13、母细胞并进行酒精发酵1.制备固定化酵母细胞流程2.制备固定化酵母细胞主要操作过程（1）酵母细胞的活化。在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要O51 h，要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。（2）海藻酸钠溶液的配制和使用：对海藻酸钠溶化时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊；溶化后先冷却至室温，再与酵母细胞混合，避免高温杀死酵母细胞；固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是
14、注射。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少影响实验效果。（3）CaCl2的作用是使海藻酸钠胶体发生聚沉，形成凝胶珠。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。（4）凝胶珠的检测：稳定30min以后，一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。【典题演示3】1（2010江苏）右图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进
15、行酒精发酵的示意图。下列叙述正确的是 A刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液 B图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠 C图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触 D图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中【答案】BCD【解析】正确掌握准备固定酵母细胞的方法和意义是关键。搞清固定过程所涉及的材料，明确酒精发酵的流程及操作意义。【变式训练6】 1、（09届盐城市摸底）下列有关固定化酵母细胞制备步骤正确的是 ( )A应使干酵母与自来水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法C向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活
16、化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀D将与酵母细胞混匀的海藻酸钠液注入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭珠形的凝胶形成 【答案】B。【解析】本题主要考查固定化酵母细胞的相关知识。考纲中的能力要求是B级。掌握固定化酵母细胞的方法和步骤是本题的解题突破口。解析过程：由于在缺水状态下，微生物处于休眠状态，为了加速酵母细胞的活化，将干酵母与蒸馏水混合后应用玻璃棒充分搅拌。为避免海藻酸钠发生焦糊，溶化时要小火间断加热。如果将刚溶化好的海藻酸钠与已活化的酵母细胞混合，有可能会杀死酵母细胞。将与酵母细胞混匀的海藻酸钠用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注入。【变式训练7】.（2009通州
17、调研）固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂（使酶相互连接），海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果（注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量），分析回答：（1）从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图所示结果可以得出的结论是_。（2）乙图曲线表明浓度为_的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低原因是_。（3）固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，由丁图可知，固定化酯酶一般可重复使用_次，酶活力明显下降。（4）固定
18、小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋，同时用戊二醛作交联剂，这是因为_。【答案】（1）固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强且应用范围较广 （2）3% 海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足 （3）3 （4）酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出【解析】理解利用固定化酶的制作、工作原理、优缺点是解决本题的突破口。固定化酶应用后易与产物分离，提高产品质量；可以反复利用，降低生产成本。但是固定化酶作为生物催化剂，具有一定的生物活性。随着时间的推移，酶的活性会降低，甚至消失，即固定化酶不能长久使用。【备用】3.（09江苏卷）酶解法制备原生质体的原理是利用酶溶液对细胞壁成分的降解作用。蜗牛酶液
19、从蜗牛（以植物为食）消化腺中提取；果胶酶、纤维素酶从微生物中提取。为了研究不同酶液的酶解效果，某实验小组取无菌烟草幼叶，切成相同大小的小片，等量放入6支试管中，试剂用量和实验结果列于下表。请回答有关问题。 试管编号项目IV蒸馏水（mL）2O1111缓冲液（mL）0210.50.50.5果胶酶液（mL）O0O0.5O0蜗牛酶液（mL）O0OO0.50纤维素酶液（mL）0O0O00.5实验结果（绿色深浅程度）+（注：“+”越多表示绿色越深，“一”表示颜色无显著变化）（1）实验过程中，需要轻摇试管，其目的是 ，使原生质体从叶小片中游离出来，以便观察悬浮液绿色的深浅。（2）从绿色的深浅可推测：蜗牛酶液
20、酶解效果最好，原因是蜗牛酶液含有 等多种酶。该实验中 是空白对照组，其设置意义是 。（3）用网筛过滤原生质体到离心管内，离心后收集沉淀物，并用 洗涤。（4）原生质体是否符合要求还需进行检验，其检验的方法是 。【答案】（1）为了使细胞壁与酶充分接触，提高酶解效果（2）果胶酶和纤维素酶 、 排除无关变量的干扰 （3）等渗溶液 （4）低渗涨破法【解析】本题考查有关酶的催化效率的实验，（1）实验过程中，需要轻摇试管，可以使细胞壁与酶充分接触，可以提高酶解效果（2）蜗牛以植物为食，所以唾液酶中含有果胶酶和纤维素酶，、没有添加酶溶液为空白对照组。其目的是排除无关变量的干扰。（3）离心后收集沉淀物，并用等渗溶液清洗，目的是保持细胞正常形态。（4）要用低渗涨破法来检验原生质体是否符合要求，若没有细胞壁则可以涨破，有则不能涨破。【总结提升】1、固定酶的方法可分为三类：载体结合法(包括共价键结合法、离子结合法、物理吸附法)、交联法和包埋法。2、固定酶的优点：可以重复多次使用，和反应物分离提纯容易。3、固定酶的缺点：只能催化单一反应，固定过程会对酶的活性产生影响。4、固定细胞的方法：包埋法，用海藻酸钠包埋。5、海藻酸钠小火融化防止烧糊，酵母菌要加水活化，溶化的海藻酸钠要冷却至室温加入活化的酵母菌搅拌均匀。6、CaCl2的作用是使海藻酸钠胶体发生聚沉，形成凝胶珠。【学生思考】