1、知识能力提升12 限制酶种类的确定及目的基因的检测与鉴定一、确定所用限制酶种类的方法1根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如上图)，而且这种切点不至于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。2根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶要与切割目的
2、基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图中限制酶pst 因其会破坏标记基因而不宜选择。(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图中Hind会破坏启动子，EcoR会破坏终止子，而Nde和BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。3根据Ti质粒的TDNA片段选择限制酶若质粒上
3、标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到TDNA片段上因为Ti质粒的TDNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba 和Sac (两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。【典例1】图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(
4、1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)分析图(a)可知，限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子
5、之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。答案：(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶目的基因插入表达载体的不同情况的分析(2020新余模拟) 分析有关基因工程的资料，回答问题。如图为构建某重组质粒的过程示意图。lacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质Xgal，从而使菌落显现出蓝色，若
6、无该基因，菌落则成白色。图中甲戊DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。(1)若酶M特异性识别的DNA碱基序列是，则酶N特异性识别的DNA碱基序列是_。 (2)过程是将所有片段混合在一起，用_酶拼接可得到不同的重组DNA。 (3)(多选)如果只考虑2个片段的组合，那么甲、乙、丁三个片段中能够形成环状DNA的片段组合是_。 A甲和乙B甲和甲C甲和丁 D乙和乙E乙和丁 F丁和丁(4)为了筛选含重组质粒的受体菌，应在通用培养基中额外加入_，培养一段时间，挑选出_色的菌落进一步培养。原来质粒中，限制酶M和N的酶切位点_。 AM位于青霉素抗性基因中，N位于lacZ基因中BN位于青
7、霉素抗性基因中，M位于lacZ基因中CM和N都位于青霉素抗性基因中DM和N都位于lacZ基因中(5)上述目的基因能够在受体细菌中表达，其原因是不同生物_。 A共用一套DNA B共用一套RNA C共用一套蛋白质 D共用一套密码子解析：质粒经过酶M和酶N的切割形成甲、乙片段，根据甲、乙片段的黏性末端可知，两种限制酶的识别序列分别是、，酶M特异性识别的DNA碱基序列是，则酶N特异性识别的DNA碱基序列是。(2)DNA连接酶可以将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来。(3)甲、乙、丁都有两个黏性末端，且都相同，因此如果只考虑2个片段的组合，那么甲、乙、丁三种片段中任意两个连接都能够连接形成环状DNA。
8、(4)为了筛选含重组质粒的受体菌，应在通用培养基中额外加入青霉素和Xgal，培养一段时间，挑选出白色的菌落进一步培养。这表明青霉素抗性基因没有被破坏，lacZ基因已经被破坏，因此，在原来质粒中，限制酶M和N的酶切位点都位于lacZ基因中。(5)上述目的基因能够在受体细菌中表达，其原因是不同生物共用一套密码子。答案：(1)(2)DNA连接(3)ABCDEF(4)青霉素和Xgal白D(5)D二、目的基因的检测与鉴定(1)在目的基因检测中，标记基因与DNA分子杂交技术所起的作用。载体上相关标记基因的作用原理。载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力
9、。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，其作用原理如下图所示：用DNA分子杂交技术检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而该质粒上是否成功嵌入了目的基因还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。(2)使用目的基因作探针，运用分子杂交技术检测目的基因是否转录
10、出特定mRNA。(3)采用抗原抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否表达出了特定的蛋白质。(4)采用抗虫、抗病毒等个体接种实验进行目的基因成功表达的个体生物学水平的检测。【典例2】(2019江苏卷)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题： (1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为_末端。(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了
11、一个碱基为_的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“”代表生长，“”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是_(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_、_。菌落类型平板类型ABC无抗生素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是_。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落
12、的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是_。解析：(1)根据题意分析，EcoR V酶识别的序列是GATATC，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。(2)依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。(3)根据以上分析可知，限制酶(EcoR V酶)切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长
13、，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。(4)据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)乙丙目的基因反向连接(1)基因工程的核心是构建基因表达载体。重组基因表达载体中的标记基
14、因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来。(2)重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的DNA分子导入相应的受体细胞中，通过在含有对应抗性物质的培养基进行培养，观察相应受体细胞的生长、繁殖情况进行判断。1(2020都匀质检)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst 、EcoR 和Hind 的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：(1)过程所用到的组织细胞是_，过程所用的酶是_。过程常用_溶液处理大肠杆菌。(2)
15、经过程得到的互补DNA片段，称为_。(3)如果用限制酶Pst 、EcoR 和Hind 对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类_(填“相同”或“不同”)，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有_种和_种。(4)如果只用限制酶Pst 切割目的基因和质粒，完成过程、后(受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙
16、、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选_的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是_。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_。(5)将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的_步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是_。解析：(1)过程获得的是人生长激素mRNA，所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过程构建基因表达载体的酶是DNA连接酶；过程将基因表达载体导入大肠杆菌前，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。(2)过程是人的生长素mRNA逆转录形成cDNA的过程。(3)Pst 、EcoR 和Hi
17、nd 三种酶的切点分别用1、2、3表示，一种酶酶切时，一共可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得到12，21，23，32，13，31六种片段；三种酶酶切时，可得到12，23，31三种片段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类相同。这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。(4)在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的pBR322质粒或含有Ampr、Te
18、tr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长。(5)将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的pBR322质粒的化学本质是DNA，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。答案：(1)人垂体组织细胞DNA连接酶CaCl2(2)cDNA(3)相同33(4)含四环素抗性基因完整
19、的pBR322质粒(或含有Ampr、Tetr的质粒)在丙中能存活，在乙中不能存活(5)筛选含目的基因的受体细胞磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基2(2020安顺模拟)双乙酰是啤酒中的主要风味物质，当啤酒中双乙酰的浓度超过一定值时，就会产生馊酸味。为此，科学家构建了低双乙酰啤酒酵母工程菌。请回答下列问题：(1)下图为重组质粒(PICG)的构建示意图。将目的基因CUP 从DNA分子切割下来所需的酶主要是从_中分离纯化而来。为获得大量的目的基因GSH ，可使用_技术，利用该技术的前提是_以便合成引物，该技术需要的酶是_。由上图可知，用_切割PLZ2质粒，将目的基因CUP 与GSH 插入到_之间，然后用DN
20、A连接酶连接。用上述限制酶切割质粒的优点是_。(2)用_作为探针来检测目的基因是否插入到酵母菌染色体上，该方法叫_。解析：(1)获取目的基因需要限制酶，而限制酶主要来自原核生物。PCR是常用于目的基因扩增的方法与手段，该方法需要一段已知目的基因合成引物。同时PCR过程中需要热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。通过对重组质粒PICG和两个目的基因末端分析，用了Bgl 和Xba 两种限制酶，用两种限制酶切割的优点是可以防止质粒以及目的基因的自身环化，同时保证了目的基因以唯一的方向插入质粒。(2)而检测目的基因是否导入到受体细胞需要用DNA分子杂交法，该方法需要用放射性同位素标记或荧光物质标记的目的基因作为探针。答案：(1)原核生物PCR扩增一段已知GSH 基因(目的基因)的核苷酸(碱基)序列热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)Bgl 和Xba 启动子与终止子可以防止质粒以及目的基因的自身环化，同时保证了目的基因以唯一的方向插入质粒(2)放射性同位素或荧光物质标记的CUP 和GSH 基因(目的基因)的片段DNA分子杂交技术