1、核心知识备查 1.基因工程的基本工具2.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取途径直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。人工合成目的基因a.化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。b.人工合成法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。c.利用PCR技术获得。(2)基因表达载体的构建重组质粒的构建(3)将目的基因导入受体细胞转化转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(4)目的基因的检测与鉴定检测：a.导入检测：DNA分子杂交法(使用DNA探针)。 转录检测：分子杂交法检测mRNAb.表达检测 翻译检测：免疫法，提取
2、蛋白质，用相应的 抗体进行抗体抗原杂交鉴定：从个体生物学水平鉴定，如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。点拨：切割质粒和目的基因的限制酶必须是同一种酶，以获得相同的黏性末端，有利于重组质粒的构建。只有第三步“将目的基因导入受体细胞”过程中不发生碱基互补配对，其他步骤均发生碱基互补配对。【例1】(2011海南高考)回答有关基因工程的问题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_（相同，不同）黏性末端的限制酶。(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰
3、岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_，常用抗原-抗体杂交技术。(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_上。【标准解答】（1）限制酶切割DNA可以产生黏性末端和平末端。一般同一种限制酶切割目的基因和质粒，产生相同的黏性末端。（2）基因表达载体中启动子是RN
4、A聚合酶特异性识别并结合的位置，驱动基因转录。用大肠杆菌作为受体细胞时，要用Ca2+处理，以利于表达载体进入。检测目的基因是否转录，可用分子杂交技术，检测目的基因是否表达出蛋白质，可用抗原抗体杂交技术。（3）目的基因插入农杆菌质粒DNA上，然后插入植物细胞的染色体上。答案：（1）平 相同 （2）提供RNA聚合酶特异性识别和结合位点，驱动基因转录 Ca2+ DNARNA分子杂交技术 胰岛素（蛋白质）（3）TDNA 染色体点拨：1.从“基因表达”层面理解基因表达载体的必需元件(1)基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点。启动子：RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录。终止子
5、：终止转录的位点。目的基因：其表达需要调控序列启动子和终止子。(2)基因表达载体的构建过程2.区分一个至多个限制酶切点与每种酶一个切点（1）一个至多个限制酶切点：作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接。（2）每种酶一个切点：因为某种限制酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。随堂练习：1.(2011四平模拟)用某人的胰岛素基因制成的DNA探针检测下列物质，能形成杂交分子的是（ ）该人胰
6、岛A细胞中的DNA该人胰岛B细胞中的mRNA该人胰岛A细胞中的mRNA该人肝细胞中的DNAA.B.C.D.【解析】选C。胰岛素基因探针的碱基排列顺序与胰岛素基因中的一条链相同，因此可以与胰岛素基因、胰岛素基因转录形成的mRNA形成杂交分子；胰岛素基因存在于所有的体细胞中，但是该基因只在胰岛B细胞中表达。2.(2011杭州模拟)应用生物工程技术获得人们需要的生物新品种或新产品，是生物科学技术转化为生产力的重要体现。请据图回答下列问题：(1)在培育转基因牛的过程中，过程需要的工具酶是_，过程常用的方法是_。(2)转基因牛可通过分泌乳汁来生产人的生长激素，在基因表达载体中，人的生长激素基因的首端必须
7、含_，它是_识别和结合位点。过程培养到桑椹胚或囊胚阶段，可以采用_技术，培育出多头相同的转基因牛犊。(3)prG基因的产物能激发细胞不断分裂，通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体，最可能是_细胞，代表的细胞具有_的特点。(4)在抗虫棉培育过程中，将目的基因导入棉花受体细胞采用最多的方法是_法。过程中的受体细胞如果采用愈伤组织细胞，与采用叶肉细胞相比较，其优点是_，过程采用的技术是_。【解析】(1)过程是获得目的基因，用限制性核酸内切酶、DNA连接酶构建重组载体过程。重组载体导入动物受体细胞通常用显微注射技术。(2)基因的首端有RNA聚合酶结合位点，是基因表达的必要条件。在未发生细胞分化的
8、囊胚期，可对胚胎进行分割处理，从而得到多个相同的个体。(3)能产生抗体的细胞是B细胞。是导入了prG基因的B细胞，既能分泌抗体，又能无限增殖。(4)因土壤农杆菌很容易感染植物细胞，所以，在培育转基因植物时，常用土壤农杆菌将目的基因导入受体细胞。当受体细胞为植物的体细胞时，需要借助植物组织培养，获得转基因植物个体。愈伤组织的细胞未分化，所以全能性较高。答案：(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射法(2)启动子 RNA聚合酶 胚胎分割移植(3)B 既能无限增殖又能产生特定抗体(4)农杆菌转化 全能性高 植物组织培养3.(2011菏泽模拟)如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，
9、请据图作答：(1)图中基因工程的基本过程可以概括为“四步曲”：即_；_；_；_。(2)能否利用人的皮肤细胞来完成过程？为什么？ _。(3)过程必需的酶是_酶，过程必需的酶是_酶。(4)若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，过程连续进行4次，至少需提供胸腺嘧啶_个。(5)在利用A、B获得C的过程中，必须用_切割A和B，使它们产生_，再加入_，才可形成C。(6)为使过程更易进行，可用_(药剂)处理D。【解析】图中过程是从细胞中获取相应的mRNA，由于基因的选择性表达，人的皮肤细胞中的胰岛素基因，不转录，因此不能形成胰岛素mRNA。从mRNADNA是逆转录的过程，需要逆转录酶。DNA分子的扩增需用
10、解旋酶将双链DNA解旋为单链。一个DNA分子中的鸟嘌呤(b个)和胸腺嘧啶之和占碱基总数(2a个)的一半，所以一个DNA分子片段中胸腺嘧啶数为(ab)个。连续复制4次，共产生DNA分子2416个，由于复制方式为半保留复制，故需要提供的胸腺嘧啶数量为(ab)(161)15(ab)。构建基因表达载体时需将目的基因与载体用同一种限制酶切割，产生相同的黏性末端，才可以在DNA连接酶的作用下连接形成基因表达载体。将目的基因导入细菌，常用Ca2+处理细菌细胞，使其变为感受态细胞，可吸收含目的基因的载体进入细菌的细胞内。答案：(1)获取目的基因 构建基因表达载体 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定(
11、2)不能；人的皮肤细胞中的胰岛素基因未表达(或未转录)，不能形成胰岛素mRNA(3)逆转录 解旋 (4)15(ab) (5)同一种限制性核酸内切酶 相同的黏性末端 DNA连接酶 (6)CaCl2(或Ca2+)考向指南一 基因工程及应用命题热点(1)基因工程的基本工具(2)基因工程的基本操作程序命题角度(1)基因工程的三大基本工具的特点及作用(2)基因工程的操作步骤及原理，有关概念的考查；设计某一转基因生物的培育过程，具体到目的基因的获取方式、表达载体的构建方法、基因检测鉴定的方法例1(2010浙江高考)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()A用限制性核酸内切酶切割
12、烟草花叶病毒的核酸B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C将重组DNA分子导入烟草原生质体D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞解析本题考查基因工程的工具和基本操作步骤，意在考查对基因工程技术操作基本过程的理解及应用于实际生产生活的能力。限制性核酸内切酶切割的是DNA，而烟草花叶病毒的遗传物质为RNA，所以A错误；目的基因与载体的连接由DNA连接酶催化连接，B正确；受体细胞为植物细胞，所以可以是烟草原生质体，C正确；目的基因为抗除草剂基因，所以筛选的时候应该用含除草剂的培养基筛选转基因细胞，D正确。答案A例2(2011山东高考)人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛
13、选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。(1)卵母细胞除从活体输卵管中采集外，还可从已处死的雌鼠_中获取。(2)图中的高血压相关基因作为_，质粒作为_，二者需用_切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有_有关。(3)子代大鼠如果_和_，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是_、早期胚胎培养和胚胎移植。解析本题主要考查基因工程、胚胎工程的相关知识，意在考查理解能力与综合运用能力。(1)卵母细胞可以从活体的输卵管中采集，也可以从处死的雌鼠的卵巢中获取。(2)
14、根据题图可以判断高血压相关基因为目的基因，质粒是载体，二者需用同种限制酶切割后连接成重组载体，该过程需要目的基因和质粒上有限制酶能识别的切割位点。(3)检测高血压相关基因是否表达，在分子水平上可检测对应的蛋白质是否合成，在个体水平上可观察其是否表现出相应的性状。(4)从题图中可以看出，所用到的胚胎工程技术主要有体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。(2)目的基因载体同种限制性核酸内切酶(或：同种限制酶)限制酶切割位点(3)检测到体内有相关蛋白出现高血压(4)体外受精答案(1)卵巢限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶与解旋酶的比较种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子
15、片段脱氧核苷酸DNA分子部位作用磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子二 细胞工程及应用命题热点(1)植物的组织培养(2)动物细胞工程命题角度此类问题在高考中常以非选择题的形式考查“动物细胞培养和细胞融合”和“植物组织培养与植物体细胞杂交”，也可能以医学实践应用和农业生产应用为背景进行考查例3(2010浙江高考)下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是()A培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞B克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变C二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的D恶性细胞系的细胞可进
16、行传代培养解析由于接触抑制，动物细胞培养时只能形成单层细胞；克隆培养法在培养时，由于所有子代细胞来自于一个亲代细胞，所以基因型一般都相同；二倍体细胞的传代培养次数通常是有限的，只有少数细胞遗传物质发生改变，才能无限增殖；恶性细胞系的细胞具有癌变的特点，可进行传代培养。答案D例4请根据植物组织培养的相关知识，完成下列问题。(1)植物微型繁殖技术属于植物组织培养的范畴。该技术可以保持品种的_，繁殖种苗的速度_。离体的叶肉细胞在适宜的条件下培养，最终能够形成完整的植株，说明该叶肉细胞具有该植物的全部_。(2)把试管苗转接到新的培养基上时，需要在超净工作台上进行，其原因是避免_的污染。(3)微型繁殖过
17、程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗_，而与_配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需要使用的生长调节剂是_(填“脱落酸”或“2,4D”)。(4)将某植物试管苗培养在含不同浓度蔗糖的培养基上一段时间后，单株鲜重和光合作用强度的变化如图。据图分析，随着培养基中蔗糖浓度的增加，光合作用强度的变化趋势是_，单株鲜重的变化趋势是_。据图判断，培养基中不含蔗糖时，试管苗光合作用产生的有机物的量_(填“能”或“不能”)满足自身最佳生长的需要。(5)据图推测，若要在诱导试管苗生根的过程中提高其光合作用能力，应_(填“降低”或“增加”)培养基中蔗糖浓度，以便提高试管苗的
18、自养能力。解析(1)叶肉细胞具有该植物的全部遗传信息，因此可经组织培养成为完整个体。(2)在组织培养过程及将试管苗转接到新培养基上时，要无菌操作，防止微生物污染。(3)在微型繁殖中，不同阶段要使用不同的激素。生长素可诱导生根，与细胞分裂素混合使用，在一定浓度配比下可促进生芽。2,4D可促进愈伤组织生长。(4)从题图看出，随蔗糖浓度增大，光合作用强度在下降，而单株鲜重是先增后降，培养基中不含蔗糖时，试管苗制造的有机物不能满足自身需要。(5)要提高试管苗光合作用能力，应适量降低蔗糖浓度。答案(1)遗传性快遗传信息(2)微生物(3)生根细胞分裂素2,4D(4)逐渐减小先增加后下降不能(5)降低1植物
19、组织培养过程中的有关概念辨析(1)外植体：用以植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。(2)脱分化：高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。(3)再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成根或芽等器官的过程。(4)愈伤组织：排列疏松、无规则，高度液泡化的无定型状态的薄壁细胞。2动物细胞培养的几个有关概念辨析(1)原代培养：是指将培养的动物细胞取出来后，先用胰蛋白酶等处理使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养箱中培养。(2)传代培养：是指需要定期地用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养的过程。(3)贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞，紧贴培养瓶内壁才能生长。(4)接触抑制现象：动物细胞在培养液中是贴壁生长，当瓶壁上被一层细胞贴满后，细胞就停止分裂，这种现象称为接触抑制现象。