1、第一章基因工程和蛋白质工程第一节基因工程的原理1简述基因工程的诞生。2简述基因工程的原理及技术。(重点)3尝试DNA的提取与鉴定。(难点)基 因 工 程 的 诞 生 与 操 作 工 具1诞生历程时间科学家事件1967年发现了DNA连接酶1970年史密斯等首次提取出核酸限制性内切酶提取了T4DNA连接酶1972年伯格等构建了世界首例体外重组的杂合DNA分子1973年科恩等成功培育出双重抗性大肠杆菌2.操作工具(1)核酸限制性内切酶“基因手术刀”(2)DNA连接酶“基因缝纫针”作用：将两个DNA片段连接起来，修复被限制性内切酶切开的切口，拼接成新的DNA分子。种类：T4DNA连接酶(把限制性内切酶
2、切开的黏性末端的缝隙“缝合”起来)。(3)载体“分子运输车”载体的特点.外源DNA的插入不影响载体在宿主细胞内的自我复制。.有适宜的限制性内切酶酶切位点，最好是对多种限制性内切酶有单一切点。.具有某些标记基因。.载体应对受体细胞无害。载体的种类：.质粒：它是细菌中独立于细菌DNA之外的小型环状DNA分子。.噬菌体或其他一些病毒。探讨：下图表示限制性内切酶切割某DNA分子的过程，从下图中可知，该限制性内切酶能识别的碱基序列及其切割位点是什么？提示：GAATTC，切点在G和A之间。探讨：结合DNA复制的过程分析，限制性内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？提示：限制性内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之
3、间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。探讨：如图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生了下述变化，则X酶是什么？提示：DNA连接酶。1核酸限制性内切酶(1)来源和种类切割DNA的工具是核酸限制性内切酶，又叫限制酶，这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今已分离出的约有4 000种。(2)作用限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)识别序列的组成一般由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成。(4)作用结果当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；而
4、当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。【特别提示】限制酶作用的结果通常有两种形式黏性末端或平末端；限制酶的作用特点体现了酶的专一性。2DNA连接酶(1)分类根据DNA连接酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：从大肠杆菌中分离得到的DNA连接酶，称为Ecoli DNA连接酶；从T4噬菌体中分离出来的DNA连接酶，称为T4DNA连接酶。(2)作用这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。【特别提示】Ecoli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“
5、缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。3载体(1)常用载体质粒质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的小型环状DNA分子。(2)载体的条件能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因；具有多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合；具有标记基因，便于进行检测和筛选。(3)其他载体在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。1下列关于限制酶和DNA连接酶的理解正确的是() 【导学号：99310001】A其化学本质都是蛋白质BDNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键
6、C在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶D它们不能被反复使用【解析】限制酶和DNA连接酶的化学本质均为蛋白质，DNA连接酶的作用是将两个DNA片段连接起来，DNA聚合酶的作用是把单个脱氧核苷酸连成脱氧核苷酸链。【答案】A2核酸限制性内切酶 的识别序列和切点是GGATCC，核酸限制性内切酶 的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶 的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶 的切点。(1)请画出质粒被限制酶 切割后所形成的黏性末端。(2)请画出目的基因两侧被限制酶 切割后所形成的黏性末端。(3)在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后的片段是否可以连接？为什么？【解析】本题考查核
7、酸限制性内切酶切割DNA的方式，将限制酶能识别的序列写出，再将限制酶切点处标出，可用虚线画出，然后可沿着虚线将片段一分为二，这样便能正确画出核酸限制性内切酶将DNA切出的黏性末端了。若限制酶切割后产生的黏性末端能互补配对，形成的黏性末端便能连接，否则不能。【答案】(1)目的基因(2)目的基因(3)可以连接；因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的(或是可以互补的)。基 因 工 程 的 概 念 与 一 般 程 序1概念基因工程是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外剪切，并与特殊的运载工具进行重新组合，然后转入另一种生物的体内进行扩增，并使之表达产生所需蛋白质的技术。它可以在分子水平上
8、定向改造生物的遗传性状。2一般程序(1)目的基因的获得目的基因：在基因操作中使用的外源基因。获取方法.直接分离法：直接从基因组中获取目的基因，最常用的方法是“鸟枪法”，又称“霰弹法”。.人工合成法：主要包括反转录法和化学合成法两种。(2)重组载体的构建方法：用同一种限制性内切酶分别切割质粒和目的基因，再用DNA连接酶将它们连接起来。重组载体的作用：携带外源DNA分子片段进入受体细胞。(3)重组载体的导入和筛选转化：将带有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，使之进入受体细胞的过程。转化方法.运用载体进行转化。.基因枪法。.显微注射法。.花粉管通道法。筛选方法：
9、利用选择培养基培养转化后的受体细胞。(4)目的基因的表达和鉴定通过检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状来进行鉴定。探讨：依据某一蛋白质的氨基酸序列合成的目的基因，其脱氧核苷酸序列是否是唯一的？提示：不是。因为一种氨基酸可能有多种密码子来决定。探讨：采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的有哪些？将毒蛋白注射到棉受精卵中将编码毒蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中将编码毒蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵提示：。探讨：如何检测抗虫棉中的毒蛋白基因是否表达？提示：让棉铃
10、虫取食抗虫棉，若棉铃虫食后死亡，说明毒蛋白基因表达。1目的基因的获取(1)从基因文库中获取目的基因基因组文库：如果一个基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库就叫做基因组文库。部分基因文库：如果一个基因文库中只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库就叫做部分基因文库，如cDNA文库。(2)人工合成目的基因有两个途径：反转录法：就是以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成单链DNA，再合成双链DNA。直接合成法：就是以已知蛋白质的氨基酸序列为基础，推出mRNA的核苷酸序列，再推出目的基因序列，然后进行人工合成。(3)利用PCR技术扩增目的基因PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较P
11、CR技术DNA复制相同点原理碱基互补配对原料四种脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子【特别提示】从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因时，目的基因已存在。人工合成目的基因时，目的基因从无到有。2重组载体的构建(1)构建目的其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)构建零件及其作用目的基因启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶
12、识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子：相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。标记基因：其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。【特别提示】由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的。3重组载体的导入与筛选(1)转化：将带有目的基因的重组载体导入受体细胞的过程。过程图解【特别提示】上图中b与a相比，b会使目的基因的遗传特性
13、得以稳定维持和表达，原因是：在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性；而a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因，其优越性在于能有效预防基因污染。不同细胞转化的比较生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法花粉管通道法显微注射法Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程a.用目的基因转化花粉受精获得转化植株b.将目的基因滴在剪开的柱头上，使其沿花粉管进入胚囊，完成转化将重组DNA分子提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(2
14、)筛选含有目的基因的受体细胞原理：质粒上有抗生素的抗性基因。方法：利用选择培养基筛选。4目的基因的表达和鉴定目的基因导入受体细胞是否能够表达要通过检测来确认，检测的方法有：(1)分子水平检测：导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测。表达检测(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。1下列不属于获取目的基因方法的是()A从基因文库中获取目的基因B转录法C反转录法D根据已知氨基酸序列合成法【解析】解答此题从如下两个方面入手分析：获取目的基因的途径有两条：一条是直接分离基因，另一条是人工合成基因。直接分离基因也就是“鸟枪法”，人
15、工合成基因又有两条途径，一条是“逆转录法”，另一条是根据已知氨基酸序列合成基因。所谓转录是指以DNA的一条链为模板，遵循碱基互补配对原则，合成mRNA的过程。此过程不能获得DNA(基因)。【答案】B2下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题。 【导学号：99310002】(1)如何将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒(重组DNA分子)?_(2)目前把重组质粒导入细菌细胞时效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通
16、质粒A，只有少数导入的是重组质粒。可以通过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：将得到的细菌涂抹在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就说明导入了质粒A或重组质粒，反之则没有。使用这种方法鉴别的原因是_。(3)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是_；原因是_。(4)导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？_【解析】(1)将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒的过程是：用一定的限制性内切酶切割质粒A，使其出现一个有黏性末端的切口；用同种限制性内切酶切割目的基因，产生相同的黏性末端；将切下的目的基因片段插入到质粒A的切
17、口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒A与目的基因结合成重组质粒。(2)检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，均需利用质粒上某些标记基因的特性，即对已经导入质粒或重组质粒的、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有标记基因的相应特性来确定。抗氨苄青霉素基因在质粒A上，而且它与目的基因是否插入无关，所以，用含氨苄青霉素的选择培养基培养经过导入质粒A处理的受体细胞，凡能生长的则表明质粒A或重组质粒导入成功，不能生长的则无质粒A或重组质粒导入。(3)抗四环素基因不仅在质粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之处，因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时，此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破
18、坏，当然含重组质粒的细菌就不能在含四环素的培养基上生长；而质粒A上无目的基因插入，抗四环素基因的结构是完整的，含质粒A的细菌就能在含四环素的培养基上生长。(4)基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译过程合成出相应的蛋白质，即人的生长激素。【答案】(1)用一定的限制性内切酶切割质粒A，使其出现一个有黏性末端的切口；用同种限制性内切酶切割目的基因，产生相同的黏性末端；将切下的目的基因片段插入到质粒A的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。(2)普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因(3)有的能生长，有的不能生长导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环
19、素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏(4)细菌细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。探 究 活 动 : 尝 试 DNA 的 提 取 与 鉴 定1实验原理(1)十二烷基磺酸钠(SDS)能够使蛋白质变性，在研磨液中加入SDS可以使蛋白质与DNA分离。乙二胺四乙酸二钠(EDTA)为DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA分子被降解。(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的许多其他物质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，我们可以提取出含杂质较少的DNA。(3)DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2活
20、动程序(1)DNA的粗提取材料准备将新鲜菠菜和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室，冷冻至少24 h。研磨称取30 g新鲜菠菜叶片，切碎。将菠菜碎片置于研钵(在冰上操作)中，加入10_mL研磨液，迅速研磨成糊状。过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菠菜研磨液滤入塑料烧杯中。离心将滤液倒入5_mL塑料离心管中，以1 000 r/min的速度离心10 min。加冷酒精从离心管中取出上清液，倒入50 mL塑料烧杯中，同时加入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精。用玻璃棒沿一个方向缓缓地搅拌溶液，溶液中会出现白色丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。(2)DN
21、A的鉴定取一支20 mL的试管，加入物质的量浓度为0.015 mol/L的NaCl溶液5 mL。将得到的丝状物放入试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向试管中加入4 mL二苯胺试剂，混匀后用沸水浴(100 )加热10 min。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化。探讨：如果实验材料改为鸡的血细胞，还需研磨吗？为什么？提示：不需要，因为动物细胞无细胞壁。探讨：在准备材料时，为什么要将菠菜叶片和酒精溶液进行预冷处理？提示：菠菜叶片预冷处理有利于破碎细胞；酒精溶液预冷处理有利于溶解DNA之外的其他物质从而提取含杂质较少的DNA。探讨：在DNA提取过程中所用的容器为什么必须是塑料的而不是玻
22、璃的？提示：由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基也带电荷而容易被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少DNA损失。1DNA提取过程中需要的物质及作用SDS使蛋白质变性，从而使蛋白质与DNA分离EDTA防止细胞破碎后DNA分子被DNA酶降解冷酒精溶解DNA分子以外的其他物质，提取出含杂质较少的DNA0.015 mol/L的NaCl溶液溶解DNA2.DNA粗提取实验成功的关键及注意事项(1)在破碎细胞释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，应不少于5 min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10 min。(2)用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的是95%的酒精，且必须经过
23、充分预冷后才能使用。(3)在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插入烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。1下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是()A酵母和菜花均可作为提取DNA的材料BDNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水C向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物DDNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝【解析】酵母菌和菜花细胞的细胞核都含有DNA，可作为提取DNA的材料，A项正确；DNA能溶解在不同浓度的NaCl溶液中，且溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，在利用渗透作用原理向生物材料中加入蒸馏水时，一方面促使细胞吸水涨破，另一方面释放
24、出的DNA也溶解在蒸馏水中，B项正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，目的是加快细胞吸水涨破，释放其中的DNA，而DNA则溶解在蒸馏水中，因此玻棒上不可能有白色絮状物，C项错误；DNA溶液与二苯胺试剂经沸水浴加热会变蓝，D项正确。【答案】C2某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下。材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 C、另一组置于20 C条件下保存24 h。DNA粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨，用两层纱布过滤，取滤液备用。第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 m
25、L体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地沿一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。第三步：取6支试管，分别加入等量的0.015 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热10 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。材料保存温度花菜辣椒蒜黄20 C20 C(注：“”越多表示蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题。(1)该探究性实验课题名称是_。(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少_。(3)根据实验结果，得出结论并分析。结论1：与20 C相比，相同实验材料在20 C条件下保存，DNA的提取量较多
26、。结论2：_。针对结论1，请提出合理的解释：_。(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是_，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。【解析】(1)分析表格可知，实验目的在于探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。(2)DNA分子为链状，很容易断裂，所以应缓缓地沿一个方向搅拌。(3)分析表格可看出，同种材料在20 时DNA提取量较多，不同材料在同种温度下保存时，蒜黄的DNA提取量最多。低温下酶活性较低，DNA降解慢。(4)根据题意，可用氯仿将DNA溶液
27、中的蛋白质析出，进一步提高DNA的纯度。【答案】(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响(2)DNA断裂(3)等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液1.在基因工程中用来修饰、改造生物基因的工具是()A限制酶和水解酶B限制酶和DNA连接酶C限制酶和载体DDNA连接酶和载体【解析】在基因工程中常用限制酶对DNA分子进行切割，用DNA连接酶把不同的DNA片段连接起来，以达到改造DNA的目的。【答案】B2下列操作中不属于重组载体构建过程的是()A用一定
28、的限制酶切割质粒露出黏性末端B用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端C将切下的目的基因片段插入质粒切口处D将重组DNA导入受体细胞中【解析】重组载体的构建过程是指把目的基因和可以用作载体的质粒等，利用限制酶和DNA连接酶进行重组的过程。【答案】D3下列是四种限制酶切割形成的8个末端，你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？(1) (2)(3)(4) (5) (6)(7) (8)【解析】(1)、(4)、(5)、(8)都是错位切形成的黏性末端，根据碱基排列顺序可确定(4)和(8)、(1)和(5)具有相同的黏性末端，能连接成功；(2)、(3)、(6)、(7)都是平切形成的平末端，根据碱基排列顺序可确定
29、(2)和(7)、(3)和(6)分别为相同限制酶切割，可连接成功。【答案】(2)和(7)能连接形成(4)和(8)能连接形成(3)和(6)能连接形成(1)和(5)能连接形成41979年，科学家将鼠体内能够产生胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中发现了胰岛素。如下图所示，请据图回答： 【导学号：99310003】(1)图中表示获得_的过程。(2)图中代表_，在它的作用下将_和_切成_末端。(3)经_的作用，将“缝合”形成_DNA分子。往往含有_基因，以便将来检测。(4)图中表示将_的过程，为使此过程顺利进行，一般需将用_处理，以增大细胞壁的_。(5)表示随大肠杆菌的繁殖而进行_。
30、(6)如在大肠杆菌细胞内发现了胰岛素，说明_。【答案】(1)目的基因(2)限制性内切酶质粒目的基因可互补配对的黏性(3)DNA连接酶重组标记(4)重组DNA导入受体细胞CaCl2通透性(5)复制(6)目的基因完成了表达的过程课堂小结：网络构建核心回扣1.限制性内切酶能识别特定的脱氧核苷酸序列，并于特定位点上准确切割双链DNA。2.DNA连接酶是连接双链DNA的专用工具酶。3.目的基因的获取方法主要有直接分离法和人工合成法。前者最常用的方法是“鸟枪法”，后者主要包括反转录法和化学合成法两种。4.载体一般具有的特点：能够在宿主细胞内自我复制；含有多种限制酶切点；具有标记基因；对受体细胞无害等。5.转化是指将带有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，使之进入受体细胞。6.为检测目的基因在受体细胞中是否表达，可进行生物学功能鉴定，即检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状。