1、 专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断.1.理解PCR的原理和反应过程。(重、难点)2.尝试PCR技术的基本操作。3.讨论PCR技术的应用。.以“DNA复制”为背景材料，设计问题，导入新课，首先回顾DNA的结构和复制的有关知识，然后了解PCR技术的原理和应用，接着讲解PCR技术的反应过程及具体实验操作步骤，后以视频观看来再次学习实验的知识点。最后通过课堂检测完善所学内容。通过对PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤变性、复性、延伸；每一步骤的作用。在教学中分析图形的同时，结合教科书中的
2、文字说明来加深理解。.DNA复制1.DNA分子能准确复制的原因有哪些？2.细胞内哪些物质是从头合成的？3.如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢?.一、DNA分子的双螺旋结构 DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为35，另一条链为5 3）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构.脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧.两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对,鸟嘌呤一定与胞嘧啶配对.二、DNA的复制 2、时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所 细胞核（主）、线粒体
3、、叶绿体4、模板 DNA母链1、概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程.5、原材料 脱氧核苷酸 6、基本条件 酶、ATP、原料、模板 7、复制过程 DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链。.RNA引物的合成 以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。DNA的生成 以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。切掉引物生成冈崎片断 在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断。.DNA片断的连接 在DNA连接酶的
4、作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA。.边解旋边复制(过程）8、复制特点 半保留复制（结果）9、遵循原则 碱基互补配对原则.10、精确复制的原因 11、复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性 规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行.PCR(聚合酶链式反应）1、DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。2、DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA
5、链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。.3、PCR原理 在80100C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。.高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。4、Taq DNA聚合酶的应用 5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引
6、物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。.PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出 6、PCR技术的特点 7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 体外的模拟 模板（母链）细胞内源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为2030个脱氧核苷酸 8、细胞内复制和PCR不同点 PCR过程中DNA的解旋不依靠解
7、旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的.PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸.变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至940C。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。2、循环过程.靶序列 靶序列 PCR 循环第一步：加热变性.复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。.PCR 循环第二步：引物与靶序列退火.延伸 DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母
8、链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。.PCR 循环第三步：引物延伸.第1个 PCR 循环完成后：得到两个拷贝的靶序列.循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 3、30次循环后靶序列扩增的数量.4、PCR 循环的结果 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。.PCR 的实验操作 1、PCR仪（一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温
9、度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次.PCR仪.1、准备 2、移液（二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上.用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂.过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 注意:3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢.将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序.过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s.4、离心 5、
10、反应 离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果.循环数 变性 复性 延伸 第一次 94C，10min 30次 4，30s 55，30s 72，1min 最后一次 4，1min 55，30s 72，1min.PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头.多聚酶链式反应扩增DNA片段全过程.1.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A92、50、72 B72、50、92 C50、92、72 D80、50、72 A.2.使用PCR仪具体实验操作顺序应为()。设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集中在离心管底部 A B C D C.3.下列操作过程的叙述中错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏 水等在使用前必须进行高压灭菌 BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存 CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换 C