1、A组基础巩固1.(2015天津六校第一次联考)在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：(1)A过程需要的酶有_。(2)要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用_处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为_态；将_在缓冲液中混合培养完成转化过程。(3)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过D_和E_。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入_。(4)如想利用分子杂交技术检测再生植株中的抗虫基因是否转录，应该用放射性同位素
2、标记的目的基因作为探针与_杂交。解析(1)图中A为基因表达载体的构建过程，该过程需要限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，还需DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组质粒。(2)将重组质粒导入微生物细胞时，常采用感受态细胞法，即首先用Ca2处理微生物细胞，使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞；然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。(3)将离体棉花叶片组织培养成再生植株还需要采用植物组织培养技术，该技术包括脱分化和再分化两个过程。由图可知，标记基因是卡那霉素抗性基因，因此可用含有卡那霉素的培养基筛选含有抗虫基因的再生植株。(4)检测目的基因是否转录出m
3、RNA常采用分子杂交技术，即以标记的目的基因为探针与mRNA分子杂交。答案(1)(同一种)限制酶、DNA连接酶(缺一不可)(2)Ca2感受重组质粒和感受态(农杆菌)细胞(答一个不给分)(3)脱分化再分化卡那霉素(4)mRNA2.(2015北京海淀期中考试)为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用_法从陆地棉基因文库中获取酶D基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因。在上述引物设计时，分别在引物中加入如图甲所示酶的识别序列，这样可以用_酶处理两个基因后，得到_端(填图中字母)相
4、连的融合基因。(2)将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的TDNA中，构建_并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含_的固体平板上培养得到单菌落，再利用_培养基震荡培养，可以得到用于转化的浸染液。(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_，进一步筛选后获得转基因油菜。(4)提取上述转基因油菜的mRNA，在_酶的作用下获得cDNA，再依据_的DNA片段设计引物进行扩增，对扩增结果进行检测，可判断融合基因是否完成_。解析(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用PCR法从陆地棉基因文库中获取酶D基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因。在上述引物设计时，分别在引物中加入如图甲所示酶的
5、识别序列，这样可以用Cla限制酶和DNA连接酶处理两个基因后，得到A、D端相连的融合基因。(2)将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的TDNA中，构建表达载体即重组质粒并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到单菌落，再利用液体培养基震荡培养，可以得到用于转化的浸染液。(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞，进一步筛选后获得转基因油菜。(4)提取上述转基因油菜的mRNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，再依据融合基因的DNA片段设计引物进行扩增，对扩增结果进行检测，可判断融合基因是否完成转录。答案(1)PCRCla(限制酶)
6、和DNA连接A、D(2)表达载体(或“重组质粒”)四环素液体(3)利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞(4)逆转录融合基因转录B组能力提升1.(2015江苏如皋期中考试)下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。请回答：(1)天然质粒往往需经过改造才能作为基因工程中的运载体，经改造后的质粒同时具备的条件有_(填序号)。标记基因多个限制酶切割位点对受体细胞无害启动子起始密码子(2)若对图1中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性将会_。(3)用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是_(从“EcoR”、“BamH/Hind”、“Sma/Hin
7、d”中选择)。不能选择其他限制酶的理由分别是_。(4)图3中，常用的导入方法是_，为了获得雌性转基因牛，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行_，过程选用的早期胚胎应发育到_阶段。解析(1)天然质粒往往需经过改造才能作为基因工程中的运载体，经改造后的质粒同时具备的条件有标记基因、多个限制酶切割位点、对受体细胞无害和启动子，而起始密码子位于mRNA上。(2)碱基之间的配对遵循碱基互补配对原则，即CG，AT，且C和G之间有3个氢键，A和T之间有2个氢键，因此C和G的含量越高，DNA分子热稳定性也越高。Sma酶切位点中均为CG碱基对，因此插入的Sma酶切位点越多，质粒中的C和G的含量就越高，其热稳定
8、性也越高。(3)若选EcoR会破坏质粒的复制原点；若选Sma/Hind，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点，所以用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是BamH/Hind。(4)过程是将目的基因导入动物受精卵，所用方法是显微注射法；为了获得雌性转基因牛，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行性别鉴定；过程将早期胚胎移入代孕母体中所用技术为胚胎移植，时期是发育到桑椹胚或囊胚的早期胚胎。答案(1)(2)提高(3)BamH/Hind若选EcoR会破坏质粒的复制原点；若选Sma/Hind，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点(4)显微注射法性别鉴定桑椹胚或囊胚2
9、.(2015河北省“五个一名校联盟” 质量监测)下图为含铁量较高转基因水稻的培育过程示意图，请分析回答：注：MS培养基为植物组织培养所用培养基(1)铁结合蛋白基因来自菜豆，若利用菜豆细胞内形成的mRNA通过逆转录过程形成 cDNA，将这些cDNA用限制酶处理后储存在受体菌群体内，这些受体菌群被称为菜豆的_。除了通过上述方法可以获取铁结合蛋白基因外，还可以通过化学合成的方法获取铁结合蛋白基因，其前提条件是_。(2)构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制性核酸内切酶分别切割_，该酶作用的部位为_(填化学键名)。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用_处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入。完整的重组Ti质粒
10、除图示结构外，还应包括_等。(3)将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得_，该筛选过程是通过在培养基2中加入_实现的。培养基3与培养基2的区别是_。检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻_。解析(1)基因文库是指将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库包括基因组文库和部分基因文库。其中基因组文库包含某种生物所有的基因，而部分基因文库只包含某种生物的部分基因，如：cDNA文库。除了通过上述方法可以获取铁结合蛋白基因外，还可以通过化学合成的方法获取铁结合蛋白基因，其前
11、提条件是该基因的脱氧核苷酸序列已知。(2)限制酶的作用部位为磷酸二酯键。构建重组质粒的过程中，通常要用同一种限制酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，使它们产生相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶连接成重组质粒。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用CaCl2溶液处理农杆菌，使农杆菌属于感受态，便于重组Ti质粒导入。基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因。(3)质粒上的标记基因为潮霉素抗性基因，因此通过培养基2的筛选培养，可以获得含有重组质粒的愈伤组织。愈伤组织再分化形成植株过程中需要加入生长素和细胞分裂素，生长素比例高时可促进根的分化，细胞分裂素比例高时可促进芽的分化，因此培养基3与培养基2的区别是生长素和细胞分裂素的浓度比例。该基因工程的目的基因为铁结合蛋白基因，因此检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻种子中铁含量。答案(1)cDNA文库(或部分基因文库)该基因的脱氧核苷酸序列已知(2)含目的基因的DNA片段和质粒磷酸二酯键Ca2启动子、终止子(3)含有重组质粒(有潮霉素抗性)的愈伤组织潮霉素生长素和细胞分裂素的浓度比例(成熟)种子中铁含量
