1、蛋白质工程一、 教学目标1.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。2.简述蛋白质工程的原理。3.尝试运用逆向思维分析和解决问题。二、 教学重点和难点1.教学重点（1）为什么要开展蛋白质工程的研究？（2）蛋白质工程的原理。2.教学难点蛋白质工程的原理。三、 教学策略1.建议采用“问题探究新问题再探究”的教学模式。本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步，学习内容较少。如何学得充实，又让学生悟出些终身学习的道理，建议采用“问题探究新问题再探究”的教学模式。新课一开始，可以带领学生回忆原有知识：要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用常规杂交育种的办法实现，但要使有生殖隔离的种间生
2、物实现基因交流，就显得力不从心了。基因工程的诞生，为克服这一远缘杂交的障碍问题，带来了新的希望。于是取得了丰硕成果：大肠杆菌为人类生产出了胰岛素，牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物，烟草植物体内含有了某种药物蛋白至此，人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识，可调动学生从书中找实例（干扰素例子、工业用酶的例子）加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。2
3、.建议加强与已有知识的联系，用逆向思维的方法解决新问题。学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图1-4所示。图1-4 遗传信息的流动方向这是学习新知识的基础。既然蛋白质的功能是由DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA。所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。结合课本中插图，可以较明确地说明这一点。还有两点教学建议需要说明。第一，蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件支撑的，正如课本中开头描述的，它是随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学的发展等因素有关（本书“前沿动
4、态”中有简要介绍）。第二，说明蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。这样学习，可以使学生认识到科学探索之路的漫长、艰辛和永无止境。四、 答案和提示（一）思考与探究1.蛋白质工程是应怎样的需求而崛起的？提示（供教师在教学中参考）：蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理论研究的需要。而结构生物学对大量蛋白质分子的精确立体结构及其复杂的生物功能的分析结果，为设计改造天然蛋白质提供了蓝图。分子遗传学的以定点突变为中心的基因操作技术为蛋白质工程提供了手段。在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产
5、，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。下面举一个如何通过蛋白质工程来提高重组-干扰素专一活性和稳定性的例子。干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然
6、产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。在基础理论研究方面，蛋白质工程是研究多种蛋白质的结构和功能、蛋白质折叠、蛋白质分子设计等一系列分子生物学基本问题的一种新型的、强有力的手段。通过对蛋白质工程的研究，可以深入地揭示生命现象的本质
7、和生命活动的规律。2.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？答：基因工程是遵循中心法则，从DNAmRNA蛋白质折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。3.你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻
8、工业以及医药工业中。-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了。通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
9、（二）正文中讨论题某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸讨论： （1） 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。（2） 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？答：（1）每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种，可以让学生根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出mRNA序列为GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或
10、C），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。（三）异想天开能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？提示：理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又
11、具有生命功能作用的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。（四）旁栏思考题1.你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？提示：人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学
12、家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。2.对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（
13、2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。前沿动态 1.动物乳腺生物反应器1987年美国科学家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白tPA（组织型纤溶酶原激活物），展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为动物乳腺反应器。为什么要用动物乳腺作为反应器生产高价值的蛋白质产品呢？这是因为动物乳房是一种高度分化的专门化腺体，合成蛋白质的能力非常强，尤其是一些经过长期的遗传改良，专门产奶的乳用动物品种，蛋白质合成能力更是惊人。一头优质奶牛，一年可产奶10 000 kg。即便是一只奶山羊，一年也可产奶2 000 kg。动物乳腺生
14、物反应器归纳起来有四大优点：产量高，且易收获目标产品，可以随乳汁分泌而排出动物体外；目标产品的质量好。动物乳腺组织不仅具有按遗传信息流向合成蛋白质的能力，而且具备一整套对蛋白进行修饰和加工的能力，如糖基化、羧化、磷酸化以及分子组装等，而微生物和植物系统都不具备这种全面的蛋白质后加工能力；产品成本低；从奶牛中提取产品，操作比较简单。正因为利用动物乳腺生物反应器生产高附加值的产品有上述优点，目前利用动物乳腺生物反应器生产医用蛋白质已成为一种风险投资产业，受到科学家、商界和医药界的高度重视。目前瞄准的目标医药产品有：血液蛋白质，如表1-2所示，这些血液蛋白质有巨大的经济效益，其中利用奶牛生产的凝血酶
15、已通过第三期临床实验，即将投放市场。第二代医用蛋白质，主要有抗体、降钙素、人的生长激素、胰岛素等药物蛋白，乳白蛋白、乳铁蛋白等营养蛋白，疫苗，组织修复物等。生产“人源化牛奶”，即用成人的乳蛋白基因替代牛的乳蛋白基因，使牛奶变成像人奶的一种基因工程奶。表1-2 一些医用蛋白质的需求情况第8因子第9因子C蛋白凝血酶抗胰蛋白酶血纤蛋白原白蛋白 市场需求量304 g 4 kg10 kg 21 kg5 t150 kg315 t单价（美元/g）290万 4万 1万 7 0005001 0003.50总价值（亿美元）8.82 1.601.00 1.502.501.5011.20 动物乳腺生物反应器的做法与转
16、基因动物的操作是相同的，只是为了将目标产品在乳汁中形成，需要使用乳腺组织中特异表达的启动子，即在目标产品蛋白质编码框的前面加上乳腺组织中特异表达的启动子等，构建成表达载体后通过注射导入受精卵中，再将其送入母体动物内，发育成动物个体，这个转基因动物就会在奶中产生所需要的目标产品。2.基因沉默转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称为基因沉默（gene silence）。这是基因工程中遇到的一个影响实际应用的重要问题。一般认为基因沉默有三种情况：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。如果外源
17、基因整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上，一般不能表达，这种现象称为位置效应产生的基因沉默。如果外源基因的启动子产生甲基化，或者外源基因异染色质化都会使外源基因不能转录，产生转录水平上的基因沉默。如果外源基因可以转录出mRNA，但mRNA不能积累，或被降解，或被相应的RNA或蛋白质封闭，使之不能翻译出蛋白质，称为转录后水平的基因沉默。如何避免基因沉默呢？这是科学家一直在努力解决的问题之一。目前主要的对策是在构建表达载体时，应可能避免外源基因与内源序列同源性过高，或者选择甲基化酶活性低的受体细胞，或选择外源基因在生物体内为单拷贝的转基因生物。3.无抗性选择标记基因的策略当前转基因植物中大部
18、分都是使用了抗生素抗性基因作为选择标记基因，由于担心这样做会对人类健康和环境带来负面影响，因此，科学工作者正在想办法消除转基因植物中的抗性基因。基本的做法有两种：一是将抗性选择标记基因和目的基因分别构建在两个不同的表达载体上，用这两种载体同时转化受体细胞，通过筛选和分子检测找到同时含有抗性筛选标记基因和目的基因的植株，通过自交，在F1代分离时，由于抗性筛选标记基因和目的基因不是在一个表达载体上，它们整合到受体细胞染色体DNA上时不在同一个位点上，两者相距较远，不会连锁，因此分离时可以将二者分开，分别存在于不同的植株中，这样就可以得到含有目的基因而不含抗性筛选标记基因的植株。二是采用位点专一性重
19、组系统，通过重组酶的作用将抗性筛选标记基因从转基因植株的DNA中切除掉。4.当前生命科学中的几个前沿研究领域基因组学基因组学是阐明各种生物基因组DNA中碱基对的排列顺序，破译相关的遗传信息的学科。目前除人类基因组的测序工作已完成外，水稻基因组、拟南芥基因组、鸡基因组等也已完成，这些工作的相继完成为揭示生命奥秘提供了基本的资料。功能基因组学基因组测序工作的完成只是为人类从基因水平认识生命本质，提供了基本的资料。功能基因组学就是要揭示每个基因在生命活动中的具体功能，为勾画整个生命蓝图，充分利用基因资料打下基础。发现新的功能基因和新的基因功能的确定，从而获得知识产权，已成为当前生命领域世界各国竞相争
20、夺的“制高点”。结构基因组学结构基因组学是继人类基因组计划之后又一个大的科学热点，是在生物的整体水平测定出全部蛋白质分子的三维结构，以及蛋白质之间、蛋白质与核酸之间、蛋白质与多糖之间、蛋白质和核酸以及多糖之间的精细三维结构，获得这些蛋白质在整个生命活动中的三维结构全息图，即单个蛋白质的三维结构，以及蛋白质与其他生物大分子结合后的复合体的三维结构状态与生命活动的关系，从而在生命整体水平上理解生命的原理。结构基因组学的研究进展，将对人类疾病机理的阐明、疾病的防治有重要意义。蛋白质组学蛋白质组学是独立于基因组学发展的一门新兴的前沿学科。它是研究一个完整的生物体（或细胞等）所表达的所有蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白质之间的相互作用等，从蛋白质水平上全面认识生物体的生理活动和病理过程。生物信息学生物信息学是综合运用生物学、信息学、数学以及计算机科学等诸多学科的理论和方法，处理和分析大规模复杂的生物信息的交叉学科。从浩瀚的生物信息数据中找出某些规律和共同点，从而揭示生命的奥秘和利用对人类有用的生物信息。