1、第十一单元生物技术实践第 42 课时 微生物的培养与应用突破考点提炼方法 考点1 生物技术手段微生物实验室培养 划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴别用途选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长培养、分离出特定微生物，如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐鉴别培养基根据微生物的代
2、谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)1培养基的类型及作用 2.培养基的配制原则和营养构成 目的要明确：根据微生物的种类、培养目的选择 不同的原料配制培养基 营养要协调：配制培养基时要注意各营养物质的 浓度和比例、pH要适宜(1)培养基的配制原则 (2)培养基的营养构成 各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。3配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤及注意事项 (1)步骤：计算称量溶化灭菌倒平板 (2
3、)注意事项 倒平板的温度一般在50左右适宜，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4纯化大肠杆菌的操作过程及注意事项 (1)原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。(2)方法：平板划线法、稀释涂布平板法。平板划线法：平板划线法中细菌的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的移动划线过程中。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。(如下图)注意 a划线时最后一区域不要与第一区域相连。b.划线用
4、力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。稀释涂布平板法 .系列稀释操作(图1)a将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。b用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。c从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步混匀操作。以此类推，直到完成最后1支 试管的稀释。注意 移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处。.涂布平板操作如图2所示：图1图2 注意 稀释涂布平板操作复杂，各个细节均应保证“无菌”。具体如下：酒精灯与培养皿的距离要合适；吸管头不要
5、接触任何其他物体；吸管要在酒精灯火焰周围使用。1自养微生物和异养微生物的营养比较 拓展提升 营养类型 碳 源 氮 源 生长因子 自养微生物 CO2、NaHCO3等含碳无机物 NH3、铵盐、硝酸盐等 一般不需要 异养微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些微生物需要 2.划分依据：自养微生物与异养微生物类型划分的主要依据是能否以无机碳作为生长的主要或唯一碳源，而与氮源无关。自养微生物以CO2或碳酸盐为主要或唯一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。3自养微生物的能源 (1)利用光能，如蓝藻等。(2)依靠物质氧化过程中释放的能量，如硝化细菌，能利用NH3氧化过程
6、中释放的化学能，NH3既作为氮源，又作为能源。4异养微生物的能源 主要来源于有机物的氧化分解，碳源不仅为异养微生物提供构成细胞的物质，而且提供完成整个生命活动所需的能量。1(2011新课标全国卷，39)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于_培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即_和_。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力_。对位训练原油
7、选择平板划线法稀释涂布平板法强 (4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和_。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰 解析(1)从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株，使用的培养基应是以原油为唯一碳源的选择培养基，通过控制碳源这种营养成分，来促进能高效降解原油的菌株的生长，抑制其他微生物的生长。(2)菌种纯化培养时，常采用平板划线法和稀释涂布平板法接种。(3)当固体培养基上长出单菌落后，可通过比较菌落周围分解圈的大小，来判断菌株降解原油能力的大小。一般来说，分解圈越大说明该菌株的降解能力越强，反之
8、则越弱。排雷 (1)平板划线操作第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的不同。(2)灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(4)实验室培养微生物的过程中，常用灼烧灭菌法对接种环、接种针、试管口、瓶口等进行灭菌；用高压蒸汽灭菌法对培养基、试管等进行灭菌；用干热灭菌法对玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等进行灭菌。实验操作应在酒精灯火焰旁进行，因为酒精灯火焰旁可形成一个无菌环境，可防止微生物的污染。考点2 生物技术实践土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 1筛选菌株的原理 微生物的选择培养：在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源
9、，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。2统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法 原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作 a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板
10、时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。3细菌分离与计数的实验流程 土壤取样样品稀释取样涂布微生物的培养观察并记录结果细菌计数 稀释度1041051061 2 3平均值1 2 3平均值1 2 3平均值菌落数/平板菌数/克土壤 4.课题延伸菌种的进一步鉴定 (1)原理：CO(NH2)2H2O CO22NH3；由于NH3的产生，培养基碱性增强，pH升高，因此可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。(2)方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。对位训练 2通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确
11、的是 ()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板 B取104、105的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于各组平板上 C将培养皿倒置，37 恒温培养2448小时 D选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数 解析 检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106稀释度的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30300的平板进行计数。答案 D 排雷(1)在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所
12、对应的稀释度计算出样品中细菌的数目，如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。(2)统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果用菌落数而不是活菌数来表示。（3判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。（4）牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基应各有一个空白对照，即不涂布菌液，目的是验证培养基中是否含杂菌。样品稀释度将直接影响平板上生长的菌落数。考点3 生物技术实践分解
13、纤维素的微生物的分离 1纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，具有催化分解纤维素的作用，其作用过程如下：纤维素 纤维二糖 葡萄糖 2纤维素分解菌的筛选原理 红色消失，出现透明圈即可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。3土壤中纤维素分解菌的筛选流程 土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。3(2011聊城一模)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答
14、问题：(1)培养基中加入的化合物A是_，为微生物的生长提供_，这种培养基属于_培养基。(2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培养基中加入_。对位训练纤维素碳源选择刚果红 (3)在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可用液体培养基培养，增加微生物的浓度。若获得纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是_，操作时采用_灭菌的方法；还可用_方法操作。(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是_。接种环灼烧稀释涂布平板防止造成环境污染 解析 (1)应用选择培养基，筛选到能产生纤维素酶的微生物，所以在培养基中要加纤维素作为唯一碳源。(2)刚果红能与培
15、养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)微生物的接种方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。接种环和涂布器都是通过灼烧的方法进行灭菌。(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是防止实验菌进入外界环境，造成污染。排雷 (1
16、)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体培养基以增加纤维素分解菌的浓度。(2)选择培养基以纤维素作为碳源和能源，其他绝大多数微生物不能正常生长；鉴别培养基因含琼脂，故为固体培养基，刚果红染色法就是应用的此培养基。(3)为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素 酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。考纲能力 运用所学知识解决自然界和社会生活中有关生物学问题的能力 考题1(2010重庆卷，31)炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病，炭疽杆菌两端截平、呈竹
17、节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。(2)细菌鉴定：实验流程如下图所示 考题链接 1.微生物的实验培养 对配制的液体培养基等需采取_方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为_(填“无机碳”或“有机碳”)。挑选可疑菌落制片后，用_观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。高压蒸汽(98 kPa蒸汽)有机碳 显微镜 接种可疑菌后，35培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是_，对照组试管中应加入_，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组_(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感
18、染；反之则排除。对排除的疑似患者及易感人群，可接种炭疽杆菌疫苗，刺激机体产生相应抗体。与产生抗体相关的细胞除T细胞、B细胞外，还有_。细菌大量繁殖等量生理盐水低吞噬细胞、浆细胞 考纲能力 探究实验设计能力 考题2 氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如表1。考题链接 2.选择培养基的用途 图1 (1)配制号固体培养基时，除添加号液体培养基成分外，还应添加1%的_。(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是_ _。(3)从用途上来说，号培养基和号培养基分别属于_培养基和_培养基。在号培养基中
19、，为SP1菌提供氮源的成分是_。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。琼脂 后灭菌 通用 选择 硝酸铵 芽孢 先调pH，(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2可知，SP1菌在_培养条件下最早停止生长，其原因是_。20 mg/L氯苯 碳源最早耗尽 解析 配制固体培养基时应在液体培养基的成分中再加入琼脂作为凝固剂。在配制培养基时应先调节pH，后进行灭菌，防止灭菌后在调节pH的过程中污染培养基。据表可知，培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，包括碳源、氮源、水、无机盐和生长因子，适用于多种微生物的培养。培养基不加牛肉
20、膏和蛋白胨，以硝酸铵为氮源，可以选择出以硝酸铵为氮源的微生物，是选择培养基。在营养缺乏、环境恶劣时，微生物可以形成休眠体芽孢，来度过不良环境。据图2可知，SP1菌在20 mg/L氯苯培养条件下菌体数最早达到最大值，即最早停止生长，原因是在培养基中，氯苯是唯一碳源，由于20 mg/L氯苯培养条件碳源最少，因此也最早被耗尽，使SP1菌停止生长。典例 培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是()化学消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 紫外线消毒 高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法 A B C D 易错警示 将消毒和灭菌混为一谈 错因分析 对酵母菌酿酒的条件模糊不清。解析 培养基用
21、高压蒸汽灭菌；培养皿耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。答案 A 纠错笔记 条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法和化学药剂消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 提醒(1)高温加热灭菌，其原理就是使细菌体内蛋白质变性，而达到杀灭细菌的作用。(2)化学药剂的灭菌消毒方法，其作用原理是使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进 入细胞内，因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。(3)体积分数为70%的乙醇杀菌效果最好。浓度过低，杀伤力弱；浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，杀菌效果受影响。对刚洗刷后未干的器皿则可选择75%的酒精进行消毒。(4)灭菌的目的：无菌技术除了用来防止实验室的培养物受其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。(5)培养基的制作是否合格的验证：如果未接种的培养基在恒温箱中保温12天后无菌落生长，说明培养基的制备是合格的，否则需要重新制备。