1、考点一基因工程的原理及工具典例引领【典例】 (2012课标，40)根据基因工程的有关知识，回答下列问题。(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_和_。(2)质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下：AATT CG GCTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR 切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即_DNA连接酶和_DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是_，产物是_。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。(5)基因工程中除质粒外，_和_也可作为运载体。
2、(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_。解析此题考查基因工程应用的相关知识。(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的末端相同，故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoR 切割产生的末端相同。(3)根据酶的来源不同，DNA连接酶分为Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为逆转录，若要体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外噬菌体和动植物病毒也可作为运
3、载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时，常用Ca2处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。答案(1)平末端黏性末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产生的相同(3)T4Ecoli(4)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(聚合酶链式反应)(5)动植物病毒噬菌体(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱1基因工程的基本原理和理论基础概括(如下图)2限制酶选择的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自
4、身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma 会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。易错警示！基因工程操作基本工具的8个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发
5、挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。跟进题组
6、1下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是()A用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大CCATG和GGATCC序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒解析切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有4个；CATG和GGATCC序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都为4个碱基；只要切割出来的黏性末端的碱基序列相同，都可以被DNA连接酶连接。答案B2.限制性核酸内切酶Mun 和限制性核酸内切酶E
7、coR 的识别序列及切割位点分别是CAATTG和GAATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是()解析由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为载体；质粒C和D的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒A上既有标记基因，且Mun 的切割点不在标记基因上。答案A考点二基因工程的操作程序典例引领【典例】 (2014北京四中期中)科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答下
8、列问题。(1)过程获得的抗盐基因可用PCR技术进行扩增，该技术必须用_酶，所需的原料是_。(2)已知几种限制酶识别序列及其切割位点如表：限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及切割位点GGATCC CCTAGGAAGCTT TTCGAAGAATTC CTTAAGCCCGGG GGGCCC用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用Sma酶切割，原因是_。图中过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用_酶对外源DNA、质粒进行切割。(3)图中、依次表示组织培养过程中抗盐烟草细胞的_、_过程。(4)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_作探针进行分子杂交
9、检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是_。解析理解转基因技术的步骤、成果是解题的关键。(1)PCR技术所需的原料是合成DNA的四种脱氧核苷酸。根据PCR反应原理，每次循环可分为在95 时进行变性，在55 时进行复性，在72 时延伸，该过程需要耐热的DNA聚合酶。(2)从图中信息可知，Sma酶的切割位点位于目的基因和M抗生素抗性基因上。分析抗盐基因的DNA片段，可知该DNA含四种限制酶切点，其中Sma位于目的基因上，不宜采用。EcoR位于目的基因两侧，若用EoR切割则目的基因会自身环化。BamH与Hind位于目的基因两端，且质粒中也有相应的合适的切割位点，因此用BamH和Hind才能完整地切
10、下该抗盐基因，同时保证目的基因与质粒连接方式的唯一性，防止自身环化。(3)转基因后的植物细胞，经脱分化产生愈伤组织，经再分化形成根、芽等，进而产生新的植株。答案(1)耐热的DNA聚合四种脱氧核苷酸(2)Sma会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因BamH和Hind(3)脱分化再分化(4)抗盐基因(或目的基因)将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态基因工程操作的基本步骤1目的基因的获取目前有两种途径：一是直接提取目的基因，如从基因文库中获取。二是人工合成目的基因，常用的方法有化学合成法和反转录法。2基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成(2)构建过程3将目的
11、基因导入受体细胞细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的TDNA上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯取卵获得受精卵显微注射早期胚胎培养胚胎移植发育成为具有新性状的动物微生物细胞Ca2处理增大细胞壁通透性原核细胞或酵母菌用Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收4.目的基因的检测与鉴定跟进题组(2014山东文登三模，35)在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。如图为获得
12、抗虫棉的技术流程。请据图回答。(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、_、将目的基因导入受体细胞、_。(2)A过程需要的酶有_和_。(3)要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用_处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为_态；然后将_在缓冲液中混合培养完成转化过程。(4)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过C_和E_。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入_。(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是_。这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是_。解析(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤
13、：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体构建过程中，需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使它们产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。(3)农杆菌转化法导入目的基因时，首先必须用Ca2处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。(4)植物组织培养过程的关键步骤是脱分化和再分化。因为只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长，故若要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入卡那霉素。(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上，检测采用的方法是DNA分子杂交技术。答案(1)基因表达载体的构建目的基因的检测与鉴定(2)限制酶DNA连接酶(3)Ca2感受重组质粒和感受态细胞(4)脱分化再分化卡那霉素(5)目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上DNA分子杂交技术