1、热点微练29 基因工程的操作程序(时间：15分钟)1.(2021山东潍坊期末)CRISPRCas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，受此机制启发，科学家们研发了CRISPRCas9基因编辑技术，这是一种对靶向基因进行特定修饰的技术，其原理是由一个向导RNA分子引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割(见下图)。(1)CRISPRCas9基因编辑复合体中Cas9蛋白是由相应基因指导，在细胞的_中合成的，其工作原理是特异性地切割目标DNA的_(填
2、化学键)；向导RNA中的碱基识别序列识别目标DNA时遵循_原则，该复合体中，决定其在DNA上切割位点的是_。(2)中国科学家从肺癌患者血液中提取某种细胞，利用CRISPRCas9基因编辑技术加入一个帮助这种细胞定向清除肿瘤细胞的新基因序列，然后再把这些细胞注入患者的血液，以达到杀死癌细胞的目的。这些细胞应该是人体的_，这种治疗方法属于_(填“体内”或“体外”)基因治疗。(3)分析上述信息可知，CRISPRCas9基因编辑技术与早期基因工程相比最明显的优势是。答案(1)核糖体磷酸二酯键碱基互补配对向导RNA中的识别序列(2)T淋巴细胞体外(3)CRISPRCas9基因编辑技术可人为地选择DNA上
3、的目标位点进行切割，目的性更强解析(1)CRISPRCas9基因编辑复合体中Cas9蛋白是在细胞的核糖体中合成的，其可切割目标DNA的磷酸二酯键；向导RNA中的识别序列识别目标DNA时遵循碱基互补配对原则，该复合体中，决定其在DNA上切割位点的是向导RNA中的识别序列。(2)在这种细胞中加入定向清除肿瘤细胞的新基因序列后，再把这些细胞注入患者的血液，可以达到杀死癌细胞的目的，可判断这些细胞应该是人体的T淋巴细胞，这种治疗方法属于体外基因治疗。(3)分析可知，与早期基因工程相比，CRISPRCas9基因编辑技术可以对靶向基因的特定位点进行编辑，故其最明显的优势是可人为地选择DNA上的目标位点进行
4、切割，目的性更强。2.(2021河北张家口质量监测)如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR 、BamH 、Sam 的切割位点，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点，已知目的基因的两端分别有包括EcoR 、BamH 、Sam 在内的多种酶的切割位点。外源DNA插入到ampR或tctR中会导致相应的基因失活(ampR表示氨苄青霉素抗性基因，tctR表示四环素抗性基因)。回答下列问题：(1)基因工程中获取目的基因常用的方法有_(答出两点即可)。(2)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有_、_等。构建重组质粒时，为避免出现自身环化，通常选用_(填图中酶名称)对该质粒和
5、目的基因进行切割，质粒被切割后断开了_个磷酸二酯键。被切割后的质粒和目的基因经DNA连接酶连接后首先导入大肠杆菌中，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用含_的培养基进行培养。答案(1)从自然界已有物种中分离、人工的方法合成(或从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、直接人工合成)(2)噬菌体的衍生物动植物病毒EcoR 、BamH 4氨苄青霉素解析(1)基因工程中获取目的基因常用的方法有从自然界已有物种中分离、人工的方法合成。(2)质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒都可作为基因工程中的载体。为避免出现自身环化，应选择的限制酶是EcoR 、BamH ，质粒被切割后断开4个磷酸二酯
6、键，由于四环素基因被破坏，所以需要用含氨苄青霉素的培养基对大肠杆菌进行培养，便于筛选出含重组质粒的大肠杆菌。3.(2021福建福州适应性练习)乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞内合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术(原理如图1)，可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义基因表达载体的结构示意图。图1反义基因技术图2反义基因表达载体(1)图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的_(填器官名称)中表达。(2)从番茄成熟果实中提取_作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合
7、成酶基因，对它们进行拼接构成融合基因并扩增。(3)合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamH 和Xba 的酶切位点，ACC合成酶基因两端含Sac 和Xba 的酶切位点，用限制酶_对上述两个基因进行切割后，再将它们拼接成融合基因，相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶_进行切割，以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因_(填“正向”或“反向”)插入启动子2A11的下游即可构成反义融合基因。(5)在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，_(填“能”或“不能”)用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因片段作探针进行检测，理由是。答案(1)果实(2)RNA(
8、3)Xba BamH 和Sac (4)反向(5)不能番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交解析(1)番茄食用的是果实，因此，启动子2A11应在番茄的果实中表达。(2)从番茄成熟果实中提取RNA作为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)使用限制酶Xba 对合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因进行切割后，两种基因有相同的黏性末端，可将二者拼接形成融合基因。相应的Ti质粒和融合基因均使用限制酶BamH 和Sac 进行切割，然后再连接，可以确保融合基因能够插入载体中。(4)为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向
9、插入启动子2A11的下游。(5)番茄细胞内本来就存在ACC氧化(合成)酶基因，能与ACC氧化(合成)酶基因探针发生分子杂交，因此，不能用放射性物质标记的ACC氧化(合成)酶基因作为探针进行检测。4.(2021辽宁锦州联合校期末)通过把编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌细胞中，使之充分表达，再经纯化可制得乙型肝炎疫苗。回答下列问题：(1)人体接种乙型肝炎疫苗后，该疫苗可作为_刺激机体发生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗先后需要接种多次，其目的是。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，则可以推测出相应目的基因的核苷酸序列，但推测出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是。(3)将
10、编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞之前需要构建基因表达载体，这一过程中需要的工具酶主要有_。构建的基因表达载体中，编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因应该位于_之间。(4)将编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因导入酵母菌细胞时，使该基因在酵母菌细胞中得以稳定遗传的关键是。答案(1)抗原使人体产生更多的抗体和记忆细胞(2)决定氨基酸的密码子具有简并性(或决定一种氨基酸的密码子往往不是只有一种)(3)限制酶和DNA连接酶启动子和终止子(4)确保编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上解析(1)乙型肝炎疫苗可作为抗原引起人体产生特异性免疫反应。乙型肝炎疫苗需先后接种多次的目的是使人体产生更多的抗体和记忆细胞，以发挥最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密码子具有简并性，根据蛋白质的氨基酸序列推测出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推测出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在构建基因表达载体过程中，需要用限制酶切割目的基因片段与载体，再用DNA连接酶把目的基因与载体连接起来。构建的基因表达载体中，启动子和终止子分别是基因表达中转录起始和终止的调控序列，目的基因需要插在启动子和终止子之间。(4)真核细胞分裂时细胞质DNA随机分配，应将目的基因插入到酵母菌细胞的染色体DNA上，以确保目的基因在酵母菌细胞中稳定遗传。
