1、理解教材新知把握命题热点应用落实体验课下综合检测 课堂回扣练习 命题点一 命题点二 知识点一 知识点二 11 DNA重组技术的基本工具 专题1 11DNA重组技术的基本工具1基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。2不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。3外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。4DNA重组技术的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和使基因进入受体细胞的载体。5限制性核酸内切酶可识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。6DNA连接酶根据来源不同可分为Ecoli DNA连接酶和T4
2、DNA连接酶。Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。7在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。基因工程的概念及其诞生与发展1基因工程的概念基因工程的别名_操作环境生物体外操作对象_操作水平_结果创造出人类需要的新的_和_DNA重组技术基因DNA分子水平生物类型生物产品2基因工程的诞生和发展(1)基础理论的重大突破：_是遗传物质的证明；DNA双螺旋结构和_的确立；_的破译。(2)技术发明使基因工程的实施成为可能：基因转移载体和_相继发现；_技术的发明；DNA体外重组得到实现，_获得成功。DNA中心法则遗传密码工具酶D
3、NA合成和测序重组DNA表达实验(3)基因工程的发展与完善：1980年，科学家首次培育出世界上第一个转基因小鼠。1983年，世界第一例_培育成功，基因工程进入迅速发展阶段。1988年_的发明，使基因工程进一步发展和完善。转基因烟草PCR技术1通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么。提示：基因重组。2将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么？提示：生物共用一套遗传密码。1基因重组的三种主要类型(1)交叉互换：减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。(2)自由组合：减数第一次分裂后
4、期，非同源染色体上的非等位基因随着非同源染色体的自由组合而组合。(3)基因工程：转基因生物因外源基因导入而获得的新性状是可以遗传的。2基因工程的理论基础(1)拼接的基础：基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。DNA重组技术的基本工具1限制性核酸内切酶(又称限制酶)(1)来源：主要是从_生物中分离
5、纯化出来的。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种_核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开。(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：_末端和_末端。原核特定磷酸二酯键黏性平2DNA连接酶(1)作用：将双链_片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_。(2)种类：种类比较项目 Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源_特点只能“缝合”具有_的双链DNA片段既可以“缝合”双链DNA片段互补的_，又可以“缝合”双链DNA片段的_大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端DNA磷酸二酯键3运载体(1)作用：将_送入细胞中。(2)种类：_、噬菌体
6、衍生物和_等。(3)外源基因质粒动植物病毒1结合DNA复制的过程分析，限制酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？提示：限制酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于碱基对之间的氢键。提示：限制性核酸内切酶。识别的碱基序列为：GAATTC，切点在G和A之间。特异性。2下图所示过程是哪类酶作用的结果？该酶识别的碱基序列及切点是什么？这体现了该类酶具有什么特性？3观察下图，分析黏性末端和平末端是如何形成的。(1)EcoRI(在G与A之间切割)：(2)SmaI(在G与C之间切割)：提示：限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分割开，就形成黏性末端，而从识别序列的中心轴线切开就形
7、成平末端。4下图中的X酶指的是什么酶？该种酶的使用是否需要选择？为什么？提示：DNA连接酶。需要。Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端。1DNA连接酶与限制性核酸内切酶的比较(1)区别：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接(2)两者的关系可表示为：2限制性核酸内切酶与解旋酶的区别(1)相同点：都是作用于DNA分子中的化学键。(2)不同点：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯键，后者作用于氢键。3DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项
8、目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同，都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制4上述四种酶的作用部位图解(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶有：限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶。(2)作用于b(氢键)的酶是解旋酶。特别提醒(1)不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(2)不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互
9、补则可以相互重新配对连接。5细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。以具体实例为素材，考查限制酶的作用及特点例 1 下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是()限制酶名称 识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHKpnEcoRSau3AHindSmaGG ATCCCA ATTCGTYR
10、 ACGGTACC G ATCCCCG GG注：YC 或 T，RA 或 G。A限制酶切割后不一定形成黏性末端B限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列思路点拨精讲精析 由表中信息可知，Hind能识别 4 种不同的核苷酸序列；Sau3A酶的切割位点在识别序列的外部；BamH酶与 Sau3A酶切割后能形成相同的黏性末端；Sma酶切割后产生的是平末端。答案 A限制酶的识别序列和切割末端的判断(1)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是
11、反向对称重复排列的。如 GCCGGCCG 以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。(2)判断黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将黏性末端或平末端之一旋转180后，看它们是否是完全相同的结构。限制酶是一种核酸切割酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamH、EcoR、Hind 以及Bgl的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是什么()ABamH和EcoR 末端互补序列为AATTBBamH和Hind 末端互补序列为GATCCEc
12、oR和Hind 末端互补序列为AATTDBamH和Bgl 末端互补序列为GATC解析：图中四种限制酶切割DNA分子所形成的黏性末端分别是CGCTAG、CGTTAA、TATCGA、TACTAG，可知BamH和Bgl切割DNA分子产生的末端的碱基是互补的。答案：D 以模式图为依托，考查运载体及其必备条件例2 目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。(2)pBR322分子中有单个EcoR限制酶作用位点，EcoR只能识别序列GAATTC，并只能在G和A之间切
13、割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR切割后所形成的黏性末端：_。(3)pBR322分子中另有单个的BamH限制酶作用位点，现将经BamH处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复_键，成功获得了重组质粒，说明_。(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_，图
14、三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。思路点拨精讲精析(1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞。(2)同一限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoR切割后所形成的黏性末端为：目的基因G AATTC G AATTCCTTAA G CTTAA G(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamH和Bgl)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含
15、四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH作用后，标记基因tetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。答案(1)筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞(2)如下所示：目的基因G AATTCG AATTCCTTAA GCTTAA G(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamH和Bgl)切割得到的黏性末端相同(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒对限制酶和载体切割位点的说明(1)若用于切割载体的限制酶有多个切点，则切割后载体
16、可能丢失含有复制起始点的片段，重组DNA分子进入受体细胞后便不能进行自主复制。(2)切点所处位置必须在载体本身需要的基因片段之外，以避免载体因目的基因的插入而失活。课堂回扣练习1以下有关基因工程的叙述，正确的是()A基因工程是细胞水平上的生物工程B基因工程的产物对人类都是有益的C基因工程育种的优点之一是目的性强D基因工程产生的变异属于人工诱变解析：基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行有目的地改造，然后导入受体细胞内，使目的基因在受体细胞内成功表达，产生出人类所需要的基因产物。因而基因工程是分子水平上的生物工程，其产生的变异属于基因重组，而不属于人工
17、诱变；基因工程虽是按照人们的意愿改造生物，目的性强，但并不是所有的基因产物对人类都有益。答案：C 2下列关于几种酶作用的叙述，不正确的是()ADNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接BRNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录C每种限制酶都能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因DDNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链解析：限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。DNA连接酶无识别的特异性，能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，DNA连接酶对于黏性末端或平末端都能催化其“缝合”，重新形成DNA分子；RNA聚合
18、酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链，复制形成新的DNA分子。答案：C 3作为基因的运输工具质粒，必须具备的条件之一及理由是()A能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D能够在受体细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选解析：质粒必须能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因；质粒分子上必须有一个至多个限制酶切割位点，供目的基因插入其中；具有某些标记基因，以便于鉴定和筛选
19、。答案：A 4利用EcoR限制酶处理下列DNA片段，被切开的部位是()A BCD解析：限制酶切断的是核苷酸之间的磷酸二酯键，而非碱基对之间的氢键。EcoR限制酶只能识别GAATTC序列，并切断G和A之间的磷酸二酯键。答案：A 5(江苏高考)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamH、Mbo、Sma4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题：(1)图 1 的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由_连接。(2)若用限制酶 Sma完全切割
20、图 1 中 DNA 片段，产生的末端是_末端，其产物长度为_。(3)若图 1 中虚线方框内的碱基对被 TA 碱基对替换，那么基因D 就突变为基因 d。从杂合子中分离出图 1 及其对应的 DNA 片段，用限制酶 Sma完全切割，产物中共有_种不同长度的DNA 片段。(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_。解析：(1)一条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“脱氧核糖磷酸
21、脱氧核糖”相连的。(2)从Sma的识别序列和酶切位点可知，其切割后产生的是平末端，图1中DNA片段有两个Sma的识别序列，故切割后产生的产物长度为5343537(bp)、79633790(bp)和6583661(bp)的三个片段。(3)图示方框内发生碱基对的替换后，形成的d基因失去了1个Sma的识别序列，故D基因、d基因用Sma完全切割所得产物中除原有D基因切割后的3种长度的DNA片段外，还增加一种d基因被切割后出现的长度为5377901 327(bp)的DNA片段。(4)目的基因的两端既有BamH的识别序列又有Mbo的识别序列，质粒的启动子之后的抗生素A的抗性基因上也有BamH和Mbo的识别序列，而抗生素B基因上只有Mbo的识别序列，若选择Mbo，则两个抗性基因都会被破坏，故应选用的限制酶是BamH，此时将抗生素B抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素B。经过同种限制酶切割后会产生相同的未端，部分目的基因与质粒会反向连接而导致基因无法正常表达。答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖(2)平 537 bp、790 bp、661 bp(3)4(4)BamH 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接