1、考点研析 课堂归纳 随堂演练 课时规范训练 第1讲 基因工程 考纲要求 全国课标卷五年考频统计 2018高考预期 1.基因工程的诞生 2.基因工程的原理及技术(含PCR)3.基因工程的应用 4.蛋白质工程 2012，T40；2013，T40(1)(2)2014全国，T40 2015全国，T40；2015全国，T40 2016全国乙，T40；2016全国丙，T40 基因工程的原理、操作步骤，在农业、工业、医学等方面的应用 考点1 基因工程的操作工具 1限制酶(1)存在：_中。(2)作用：_，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开。答案：1.(1)原核生物(2)识别双链DNA分子的某种特定
2、核苷酸序列 磷酸二酯键 3形成末端类型识别序列中心轴线两侧切开 识别序列中心轴线处切开 答案：(3)黏性末端 平末端 2DNA连接酶(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)种类 Ecoli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 _ _ 特点 只“缝合”_末端 黏性末端和平末端都可“缝合”答案：2(2)大肠杆菌 T4噬菌体 黏性 3.载体(1)条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点；具有标记基因。(2)种类最常用：其他：、动植物病毒(3)作用：_。答案：3(2)质粒 噬菌体的衍生物(3)携带外源DNA片段进入受体细胞 注意
3、：(1)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。(2)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较 名称 作用部位 作用底物 形成产物 限制酶 磷酸二酯键 DNA分子 带黏性末端或平末端的DNA片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 重组DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 子代DNA分子 热稳定DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 子代DNA分子 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA分子 游离的脱氧核苷
4、酸 解旋酶 碱基对间的氢键 DNA分子 脱氧核苷酸长链 RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 单链RNA分子 题组精练 1图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamH、Mbo、Sma 4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题。(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由_连接。(2)若用限制酶Sma 完全切割图1中DNA片段，产生的末端是_末端，其产物长度为_。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被TA碱基对替换，那么基因D就突变
5、为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma 完全切割，产物中共有_种不同长度的DNA片段。(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是_。解析：(1)题干中强调“一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基”，可通过画出DNA结构示意图解决。(2)Sma 识别并切割的序列为CCCGGG，所以产生的末端为平末端，经Sma 切割后，DNA片段会形成三个小的DNA片段，按切
6、割位点算分别是：5343537(bp)；79633790(bp)；6583661(bp)。(3)用Sma 切割基因D，会形成537 bp、790bp、661 bp三种类型。题图1中虚线方框内CG被TA替换，失去了一个酶切位点，则会被切割成53479631 327(bp)和6583661(bp)两种类型。所以一共会得到537 bp、790 bp、1 327 bp、661 bp 4种类型的片段。(4)根据基因D和质粒的核苷酸序列可知，可选用BamH 和Mbo 进行切割，但Mbo会破坏掉两种抗生素抗性基因，因此只能用BamH 进行切割。答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖(2)平 537 bp、79
7、0 bp、661 bp(3)4(4)BamH 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接 2下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种 限 制 酶 切 割，酶 切 后 的 载 体 和 目 的 基 因 片 段，通 过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH 酶切
8、的DNA末端与Bcl 酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A 切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。解析：(1)选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为Bcl、Hind、BamH和Sau3A，但由于BamH 和Sau3A 可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用Bcl、Hind 两种限制酶切割。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。(2)根据质粒上抗性基
9、因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。(3)若BamH 酶切的DNA末端和Bcl 酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为T GATC CA CTAG GG GATC AC CTAG T，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。(4)根据Bcl、BamH 和Sau3A 的酶切位点，Sau3A 在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB
10、、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A 切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。答案：(1)Bcl 和Hind DNA连接 感受(2)四环素 引物甲和引物丙(3)T GATC CA CTAG G G GATC AC CTAG T 都 不 能(4)71确定限制酶的种类(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶
11、的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma 会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。2载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系
12、中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：考点2 基因工程的操作过程与应用 1目的基因的获取(1)目的基因：主要指_的基因，也可以是一些具_作用的因子。(2)方法从 中获取人工合成利用 合成通过 用化学方法人工合成利用PCR技术扩增答案：1.(1)编码蛋白质 调控(2)基因文库 mRNA反转录 DNA合成仪 注意：(1)基因组文库与部分基因文库 基因文库类型 基因组文库 部分基因文库(cDNA文库)构建基因文库的过程(2)PCR技术 原理：DNA复制 需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)过程：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物
13、与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因_，同时使目的基因能够表达和发挥作用。答案：2(1)在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代(2)基因表达载体的组成 答案：(2)RNA聚合酶 转录 转录 目的基因 (3)构建过程 答案：(3)同种限制酶 DNA连接 3将目的基因导入受体细胞(1)受体细胞种类不同，导入方法不同 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 _ _ _ 受体细胞 体细胞 _ 原核细胞 答案：3(1)农杆菌转化法 显微注射法 感受态细胞法 受精卵 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的TD
14、NA上导入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达 将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物 Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(2)基因工程产物不同、选择的受体细胞类型也不相同 培育转基因植物：受体细胞可以是受精卵、体细胞(需经植物组织培养成为完整植株)。培育转基因动物：受体细胞为受精卵，若用体细胞作为受体细胞，则需经核移植技术培养成转基因动物。生产蛋白质产品：一般选用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞，因原核生物具有一些其他生物没有的特点，如繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。4目的基因的检测与鉴
15、定 注意：(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(1)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。题组精练 1根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)cDNA文库属于_基因文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的_反转录产生的cDNA片段，与_连接后储存在一个受体菌群中。(2)切割DNA分子的工具是_，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开，形成黏性末端
16、或平末端。(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是_DNA连接酶。(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是_；如果受体细胞是大肠杆菌，需要用_处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。解析：(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库如cDNA文库。cDNA文库构建的方法是：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的cDNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中。(2)切割DNA分子的工具是限制酶，它作用的化学键是磷酸二酯键。限制酶切割DNA后形成黏性末端或平末端。(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T
17、4DNA连接酶两类，前者只可“缝合”黏性末端，后者既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端。(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法；如果受体细胞是大肠杆菌，需要用Ca2处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。答案：(1)部分 mRNA 载体(2)限制性核酸内切酶 磷酸二酯键(3)T4(4)农杆菌转化法 Ca2 2(2017湖北武汉2月调研)如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。请回答：(1)AB利用的技术称为_，其中过程需要热稳定的_酶才能完成。(2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过C过程，该过程为构建_，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下
18、一代，并能表达。(3)上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是_法，该方法一般_(填“适宜”或“不适宜”)用于将目的基因导入单子叶植物。(4)从FG的过程利用的主要技术为_，欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做_实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占_。解析：(1)AB是PCR技术中的操作，过程是PCR技术中的延伸过程，需要耐热的DNA聚合酶参与。(2)过程C是构建基因表达载体。(3)图中显示，将目的基因导入棉花细胞的方法是农杆菌转化法，该方法不适于将目的基因导入单子叶植
19、物，这是因为农杆菌对大多数单子叶植物没有感染力。(4)FG过程是将棉花体细胞培育形成新的个体，需要采用植物组织培养技术；检测抗虫基因在转基因植株体内是否表达，在个体水平上需要做抗虫接种实验；假设抗虫基因为A，则该杂合子基因型可以表示为A0，A0自交，后代中抗虫植株A_和非抗虫植株00分别占3/4、1/4。答案：(1)PCR Taq DNA聚合(2)基因表达载体(3)农杆菌转化 不适宜(4)植物组织培养 抗虫接种 3/4 考点3 基因工程的应用及蛋白质工程 1基因工程的应用(1)植物基因工程 外源基因类型及举例 成果举例 抗虫转基因植物 抗虫基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基
20、因、植物凝集素基因 抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米 抗病转基因植物(1)抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因；(2)抗真菌基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因 抗病毒烟草、抗病毒小麦 抗逆转基因植物 抗逆基因：调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因 抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米 改良品质的转基因植物 优良性状基因：必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因 高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛(2)动物基因工程 外源基因类型及举例 成果举例 提高生长速度的转基因动物 外源生长激素基因 转基因鲤鱼 改善畜产品品质的转基因动
21、物 肠乳糖酶基因 乳汁中含乳糖较少的转基因牛 生产药物的转基因动物 药用蛋白基因乳腺蛋白基因的启动子 转基因动物具有乳腺生物反应器 作器官移植供体的转基因动物 外源的抑制抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因 无免疫排斥反应的转基因猪(3)基因治疗与基因诊断 基因治疗 基因诊断 原理 基因重组及基因表达 DNA分子杂交 方法 将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，以达到治疗疾病的目的 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况，判断患者是否出现了基因异常或携带病原体 进展 临床实验 临床应用 注意：(1)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
22、一般称为“工程菌”，如含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株。而青霉素是诱变后的高产青霉菌产生的，不是通过基因工程改造的工程菌产生的。(2)用基因工程生产的药品，从化学成分上分析都应该是蛋白质类。(3)动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。(4)并非所有个体都可作为乳腺生物反应器，制备乳腺生物反应器通常是针对雌性个体进行的操作。2蛋白质工程(1)缘由：基因工程原则上只能产生_的蛋白质。(2)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。(3)手段：基因修饰或基因合成。(4)目的：合成满足人类生产和生活需求的蛋白质。(5)流程：(6)蛋白质工程中通过对基因操作来实现对
23、天然蛋白质改造的原因：改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。对基因进行改造比对蛋白质进行直接改造要容易操作，难度要小得多。3蛋白质工程与基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 区 别 过程 预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列合成DNA表达出蛋白质 目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定 区 别 实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质 联系,蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代
24、基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现答案：2.(1)自然界已存在题组精练1干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染和癌症，但体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸转变成丝氨酸，就可在70 条件下保存半年，请根据以上信息回答下列问题：(1)蛋白质的合成是受基因控制的，因此获得能够控制合成“可以保存的干扰素”的基因是生产的关键，依据蛋白质工程原理，设计实验流程，让动物生产“可以保存的干扰素”。写出下列方框中相应的实验步骤。A_；B._；C_；D._。(2)基因工程与蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产_的蛋白质，不一定符合_需
25、要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过_或_，对现有蛋白质进行_，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需要。(3)蛋白质工程实施的难度很大，原因是蛋白质具有十分复杂的_结构。(4)对天然蛋白质进行改造时，应该直接对蛋白质分子进行操作，还是应该通过对基因的操作来实现？_，原因是_。解析：本题综合考查了蛋白质工程与基因工程的异同，并考查了蛋白质工程的原理及其在生产实践中的应用。蛋白质工程是研究蛋白质的结构和功能、蛋白质折叠、蛋白质分子设计等一系列分子生物学问题的一种新型的、强有力的手段。通过对蛋白质工程的研究，可以深入地揭示生命现象的本质和 生 命 活
26、动 的 规 律。基 因 工 程 遵 循 中 心 法 则，从DNAmRNA蛋白质，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程则是按照相反的思路进行的，其基本流程是预期蛋白质的功能设计蛋白质的三维结构推测应有的氨基酸序列合成相应的脱氧核苷酸序列创造出需要的蛋白质。答案：(1)预期蛋白质的功能 蛋白质的三维结构 应有的氨基酸序列 相应的脱氧核苷酸序列(基因)(2)自然界已存在 人类生产和生活的 基因修饰 基因合成 改造(3)空间(或高级)(4)应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造 首先，任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过
27、的基因遗传下去；如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子也无法遗传。其次，对基因进行改造比直接对蛋白质进行改造要容易操作，难度要小得多 2已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_基因或合成_基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制，以及
28、遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物_进行鉴定。解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如
29、下图所示：由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列合成DNA表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(2)P P1 DNA 和 RNA(或 遗 传 物 质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、
30、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能 课堂归纳 易错清零 易错点1 混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子，不明确标记基因的作用 提示 启动子起始密码子，终止子终止密码子(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。(2)终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)，从而将含目的基因的细胞筛选出来。易错点2 误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”提示(1)在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。随堂演练课时规范训练