1、纵观近年高考，选修3基因工程几乎是必考内容，是高频考点，考查内容包括基因工程的原理、基因工程的工具，基因工程的基本步骤及基因工程的应用等，然而，相关内容考查时常常涉及限制酶的选择及目的基因的检测与鉴定等，针对选择何种限制酶的问题，应为难点，区分度高，失分严重，为此，为总结规律，归纳方法，特设置本课。【例证1】(2016全国课标卷，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可
2、以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_ _。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图(c)所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。慧眼识图 获取信息(1)三种限制酶切割结果分析(2)表达载体与重组DNA分子分析 答案(1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被
3、转录(3)EcoliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶【例证2】(2016江苏卷，33)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6
4、个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。首先看目的基因两侧有何种切割位点以保障能将目的基因“切出”如图2使用BamH、Bcl可切断左侧，Hind、Sau3A可切断右侧 再回扣“质粒”，看质粒中限制酶切割位点，如图中总共有BamH、Bcl、BamH及Hind四个限制酶识别位点，其中并不存在诸如目的基因中Sau3A 酶识别位点，故不选Sau3A 酶，而BamH在四环素抗性基因与氨苄青霉素抗性基因中均存在，倘若使用该酶将会导致两个标记基因同时被破坏，故只能选择Bcl与Hind，而使用此
5、两类酶将导致氨苄青霉素抗性基因遭破坏，因此制备重组质粒选择培养基时只能依据“四环素抗性基因”，如下图所示：此外，根据 BamH和 Bcl的酶切位点，BamH酶切的 DNA 末端与 Bcl酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为T GATC CA CTAG GG GATC AC CTAG T，与两种酶的酶切位点均不同。又根据BamH、Bcl和 Sau3A的酶切位点，Sau3A在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为 A、B、C 三种片段，若部分位点被切开，可得到 AB、AC、BC、ABC 四种片段，所以用 Sau3A切图 1 质粒最多可能获得 7 种大小不同的 DNA 片段。答
6、案(1)Bcl和 Hind DNA 连接 感受(2)四环素 引物甲和引物丙(3)T GATC CA CTAG GG GATC AC CTAG T 都不能(4)71.限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不致于完全破坏“标记基因”。(2)
7、根据质粒的特点确定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst 因其会破坏标记基因而不宜选择。所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hind会破坏启动子，EcoR会破坏终止子，而Nde、Xba及BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
8、若质粒上标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到TDNA片段上因为Ti质粒的TDNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba 和Sac(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取因甲、乙的酶切位点均不位于TDNA片段上,丁的酶切位点虽位于Ti质粒上，但其没有Sac切点其切出的黏性末端，不能与目的基因黏性末端吻合，故只有丙图所示Ti质粒宜作选择对象(目的基因两侧有Xba、Sac 位点)2.目的基因的检测与鉴定(1
9、)界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含目的基因，原理如下图所示：“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定(具有标记基因)的
10、质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。(2)使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。(3)采用“抗原抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。(4)采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。1.如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是()A.HindB.EcoR C.Eco BD.Pst 解
11、析 A处有BamH、Eco B、Cla 限制酶的切点，使用AD中的Eco B切割时，才能让目的基因插入到A处。答案 C 2.为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将从陆地棉基因库中获取的酶D基因与位于拟南芥叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得转基因油菜品种。酶D基因、转运肽基因所含三种限制酶(Cla、Sac、Xba)的切点如图所示。请回答下列问题：(1)用限制酶_和_酶处理两个基因后，可得到A、D端相连的目的基因。(2)将上述目的基因插入如图所示质粒的_中，构建_，然后将其导入农杆菌中。(3)利用_法将目的基因导入油菜叶片中，并通过筛选获得转基因油菜细胞，通过_技术可培育成转基因油菜植株。(4)用_技术可检测转基因油菜的染色体DNA上是否插入了目的基因，用_技术可检测转基因油菜植株中的目的基因是否翻译成蛋白质。答案(1)Cla DNA连接(2)TDNA 基因表达载体(3)农杆菌转化 植物组织培养(4)DNA分子杂交 抗原抗体杂交