1、现代生物科技专题第1讲基因工程考情研读备考定位考点展示核心素养1简述基因工程的诞生。2简述基因工程的原理及技术。3举例说出基因工程的应用。4简述蛋白质工程。5活动：DNA的粗提取和鉴定。6活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。1生命观念结构决定功能：基因的结构与功能。2理性思维建立模型：理解基因工程的操作流程。3科学探究解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程。学会细胞中的DNA的提取和鉴定方法，学习PCR技术原理和操作。考点一基因工程的操作工具自主回顾素养储备基础梳理1基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：体外。(3)
2、操作水平：分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体体内表达。(7)优点与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。2DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。结果：产生黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶种类：常用类型Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二
3、酯键以连接两段DNA片段。(3)载体种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。质粒特点思维辨析易错整合，判断正误。(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()(3)限制酶只能用于切割目的基因()(4)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来()(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶()(6)Ecoli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()(7)用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点()(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达()延伸探究1
4、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。提示不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个脱氧核苷酸。2原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA?提示原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。3思考并表述在基因工程的基本操作步骤中，哪些步骤发生了碱基互补配对？提示第一步中，碱基互补配对发生在用反转录法合成目的基因或PCR技术扩增目的基因的过程中；第二步中，碱基互补配对发生在黏性末端相互连接过程中；第四步目的基因的检测与鉴定步骤中分子杂交及基因表达时存在碱基互补配对。4将目的基因导入受体细胞整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，能否稳定遗传？说明理由。
5、提示一般不能。因为仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，细胞分裂可能导致目的基因丢失，因此无法稳定遗传。5动物基因工程中，为何常选用动物的受精卵作为受体细胞？提示受精卵的全能性高，能使目的基因在相应的组织和器官中得以表达。剖析难点考点突破重难精讲1基因工程的理论基础2基因工程的工具酶(1)几种酶的比较比较项目限制酶DNA连 接酶 DNA 聚合酶 解旋酶 DNA(水 解)酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核 苷酸DNA分子DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间 的氢键磷酸二酯键 作用结果产生黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子形成
6、游离的脱氧核苷酸 (2)限制酶与DNA连接酶的关系3限制酶的特点与使用(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。关于工具酶的五
7、个注意点(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(2)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(4)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(5)DNA连接酶起作用时，不需要模板。4载体(1)载体种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。(2)作用作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目
8、的基因进行大量复制。(3)作为载体的条件条件适应性稳定存在并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择(1)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(2)载体上标记基因的标记原理：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中
9、加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：精准命题典例剖析例1(2021乐山期末)某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与运载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是(A)A获取基因a的限制酶的作用部位是图中的B基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒C连接基因a与运载体的DNA连接酶的作用部位是图中的D一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子解析获取基因a的限制酶其作用部位是图中的磷酸二酯键，A正确；基因工程所用的工具酶是
10、限制酶、DNA连接酶，质粒是基因工程常用的运载体，不是工具酶，B错误；连接基因a与运载体的DNA连接酶其作用部位是图中的磷酸二酯键，C错误；一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，D错误。技巧点拨确定限制酶种类的两种方法(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质
11、粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。对应训练1下列是基因工程的有关问题，请回答：(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是黏性末端和平末端。(2)目的基因和载体重组时需要的工具
12、酶是DNA连接酶，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列无(填“有”或“无”)专一性要求。(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶的识别序列和切割位点是GGATCC，限制酶的识别序列和切割位点是GATC。分析可知，最好选择限制酶切割质粒，限制酶切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是限制酶切割质粒不会把两个标记基因都破坏、目的基因两端均有限制酶的识别序列。解析(1)限制性核酸内切酶(限制酶)能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，分别为黏性末端
13、和平末端。(2)目的基因和载体重组时需要DNA连接酶恢复所连接的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。多种限制酶切割，形成不同的切割位点，所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列没有专一性要求。(3)由题干及图示可知，限制酶的识别序列和切割位点是GGATCC，限制酶切割质粒不会把两个标记基因都破坏，最好选择限制酶切割质粒。限制酶的识别序列和切点是GATC，目的基因两端均有限制酶的识别序列，因此用限制酶切割目的基因所在的DNA。考点二基因工程的基本操作程序自主回顾素养储备基础梳理基因工程的基本操作程序1目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。(2)获取方法
14、2基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子及标记基因等。3目的基因导入受体细胞受体细胞类型方法植物细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物细胞显微注射技术(注射到受精卵内)微生物细胞感受态细胞法(Ca2处理法)4目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病
15、的接种实验是否表现出相应的特性思维辨析易错整合，判断正误。(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制()(3)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点()(4)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法()(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体()(6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达()(7)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测()(8)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术()延伸探究据图分析抗虫棉的培育过程(1)该基因工程中的目
16、的基因和载体分别是什么？切取目的基因与切割载体时只能使用同一种限制酶吗？(2)目的基因的插入位点是随意的吗？ (3)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？(4)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？提示(1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平)末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体各具有两个不同的末端。
17、(2)不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。(3)采用的方法是农杆菌转化法；由于Ti质粒上的TDNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了TDNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。(4)抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。剖析难点考点突破重难精讲1目的基因的检测与鉴定2基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的
18、组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性关于基因工程的四个注意点(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。(2)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象；第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在分子水平杂交检测。3利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)目的：短时间内大量扩增目的基
19、因。(3)原理：DNA双链复制。(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。(5)过程过程说明图解变性温度上升到90 左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72 左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5端向3端延伸精准命题典例剖析例2(2021黑龙江哈尔滨六中第二次月考)绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的，为了培育能发出绿色荧光的小鼠，人们设计了如下的流程：(1)获取绿色荧光蛋白基因的常用方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成等。(2)绿色荧光蛋白基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物一部分基因的文库
20、称为cDNA文库(或部分基因文库)。(3)A过程是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键。(4)B过程常用的是显微注射技术。(5)通常采用DNA分子杂交技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。解析图中A表示基因表达载体的构建过程，B表示将目的基因导入受体细胞，C表示早期胚胎培养，D表示胚胎移植，E表示妊娠。(1)获取目的基因绿色荧光蛋白基因的方法有从基因文库中获取和人工合成等。(2)基因文库分为基因组文库和部分基因文库，其中含有一种生物所有基因的文库称为基因组文库，含有一种生物的部分基因的文库称为部分基因文库，如cDNA文库。(3)A过程表
21、示基因表达载体的构建，是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键。(4)将目的基因导入动物细胞采用的最多也最有效的方法是显微注射技术。(5)检测外源基因是否插入了小鼠的基因组，通常采用DNA分子杂交技术，即用外源基因制作成的DNA探针与受体细胞的基因组进行杂交，观察是否出现杂交带。 对应训练2(2019全国卷，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在
22、体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至9095_。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。解析(1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(9095 )使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)大肠杆菌DNA聚合酶
23、不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。3(2021福建三明一中高三开学考)如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答：(1)能否利用人的皮肤细胞来完成过程？不能。为什么？由于基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不能表达，得不到胰岛素mRNA。(2)过程必需的酶是逆转录酶，过程在体外需要的条件是加热，过程在体外必需的酶是热稳定DNA聚合(Taq)酶。(3)在利用A、B获得C的过程中，必须用同一种限制酶切割A和B，使它们产生相同的黏性末端，再加入DNA连接酶，才可形成C。(4)C的组成除必须含有目的基因、标
24、记基因、复制原点外，还必须有启动子和终止子。(5)图中的D是基因工程中的受体细胞，为了使过程更易进行，可用Ca2处理D。解析(1)由于基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不表达，从皮肤细胞中无法获得胰岛素基因转录的mRNA。(2)过程是逆(反)转录，需要逆转录酶。过程是解旋，在体外需要的条件是加热。过程是以DNA一条链为模板合成子代DNA，在体外必需的酶是Taq酶。(3)A、B分别是目的基因和质粒，C是重组质粒，此过程中，必须用同种限制酶切割A和B，使它们产生相同的黏性(或平)末端，再加入DNA连接酶，才可形成重组质粒。(4)重组质粒除必须含有目的基因、标记基因、复制原点外，还必须有启动子
25、和终止子。(5)为了使受体细胞更容易吸收重组质粒，可用Ca2处理，使其处于感受态。考点三基因工程的应用和蛋白质工程自主回顾素养储备基础梳理1基因工程的应用(1)转基因植物植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。(2)转基因动物动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。(3)基因工程药物来源：转基因的工程菌。成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。(4)基因治疗方法：把正常基因导入病人
26、体内，使该基因的表达产物发挥功能。效果：治疗遗传病的最有效的手段。分类：体内基因治疗和体外基因治疗。2蛋白质工程(1)概念理解基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。操作：基因修饰或基因合成。结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。目的：满足人类的生产和生活的需求。(2)操作过程从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)基因表达产生需要的蛋白质。思维辨析易错整合，判断正误。(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株()(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的
27、血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中()(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用()(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质()(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质()(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构()延伸探究1利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠，分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？提示药用蛋白基因没有转录或翻译。2几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。在进行基因工程操作时，若要从植物体中提
28、取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是什么？提示嫩叶组织细胞易破碎。3对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？提示通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。原因是任何蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功了，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传。剖析难点考点突破重难精讲1蛋白质工程与基因工程的关系项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载
29、体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造二者都属于分子水平的操作，蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程。2体外基因治疗与体内基因治疗的区别方法比较体外基因治疗体内基因治疗不同点途径从患者体内获得某种细胞体外完成基因转移筛选、细胞扩增输入体内直接向患者体内组织细胞中转移基因特点操作复杂
30、，但效果可靠方法较简单，但效果难以控制相同点都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段3基因治疗与基因诊断原理操作过程 进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗临床实验基因诊断 碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况临床应用精准命题典例剖析例3(2020河北衡水中学联考)人胰岛素由A、B两条肽链构成。研究人员用大肠杆菌作生产菌，利用基因工程技术分别生产两条肽链，并在体外将两条肽链加工成胰岛素。请回答下列问题(1)由A、B两条肽链可推导出A、B基因的碱基序列，依据是氨基酸与密码子的对应关系。 因为A、B
31、基因中的脱氧核苷酸数较少，因此常用人工合成的方法获取目的基因。 (2)在基因表达载体中，标记基因的作用是便于重组DNA(目的基因表达载体)的鉴定和筛选。 基因工程中不能将A、B基因直接导入大肠杆菌的原因是A、B基因(目的基因)在大肠杆菌中不能稳定遗传和表达。 (3)检测A、B基因是否导入受体菌时，常用放射性物质标记的A、B基因作探针。若A、B基因表达的肽链中氨基酸数目增多，肽链后延，则需对A、B基因进行改造，这个改造是添加上能转录出终止密码子的碱基(脱氧核苷酸)序列。(4)引导肽是由引导肽基因控制合成的一段多肽序列，若在A、B肽链的前端加上引导肽序列后，可将A、B肽链引导到大肠杆菌的细胞膜外，
32、便于A、B肽链提取。为实现上述目的，在基因层面的操作是将A、B基因连接在引导肽基因后。在以后的体外加工过程中，需要用蛋白酶切除引导肽。 解析(1)因肽链中的氨基酸是由密码子决定的，基因在表达过程中遵循碱基互补配对原则，所以根据氨基酸与密码子的对应关系，可依据A、B两条肽链中氨基酸的序列推导出mRNA的碱基序列，进而推出A、B基因的碱基序列。因为A、B基因中的脱氧核苷酸数较少，导致A、B基因较小，因此常用人工合成的方法获取目的基因。(2)在基因表达载体中，标记基因的作用是便于重组DNA(目的基因表达载体)的鉴定和筛选。由于A、B基因(目的基因)在大肠杆菌(受体菌)中不能稳定存在、遗传和表达，所以
33、基因工程中不能将A、B基因直接导入大肠杆菌。(3)探针是将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上，用放射性同位素等作标记而制成。可见，检测A、B基因是否导入受体菌时，常用放射性物质标记的A、B基因作探针。若A、B基因表达的肽链中氨基酸数目增多，肽链后延，说明缺少终止密码子，则需在A、B基因上添加上能转录出终止密码子的碱基(脱氧核苷酸)序列。(4)由题可知，将A、B基因连接在引导肽基因后形成融合基因，这个融合基因表达的产物融合蛋白的前端为引导肽，可将融合蛋白引导到大肠杆菌的细胞膜外。在体外加工过程中，用蛋白酶切除引导肽，便可获得A、B肽链。对应训练4(2021大庆质检)镰
34、刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的碱基对(或脱氧核苷酸)序列发生改变。(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作不属于(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰)。(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的mRNA(或RNA)，以其作为模板，在逆转录酶的作用下反(逆)转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和DNA连接酶的
35、作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。解析(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造，因此不属于蛋白质工程。(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反(逆)转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体
36、菌中提取蛋白质，进行抗原抗体杂交实验加以判断。考点四DNA的粗提取与鉴定自主回顾素养储备基础梳理1实验原理2操作流程 思维辨析易错整合，判断正误。(1)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替()(2)进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分地研磨()(3)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度()(4)在溶有DNA的 NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色()(5)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同()(6)实验中两次使用蒸馏水的目的不同()延伸探究下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
37、(1)操作和都是加入蒸馏水，其目的一样吗？(2)操作中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？(3)操作中的黏稠物是如何获取的？加入2 mol/LNaCl的目的是什么？提示(1)不一样。是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 molL1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。(2)中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。剖析难点考点突破重难精讲1DNA和蛋白质在不同NaCl溶液中的溶解度比较2 mol/LNaCl溶液0.1
38、4 mol/LNaCl溶液溶解规律DNA溶解析出蛋白质部分发生盐析沉淀溶解NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大2DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”加蒸馏水2次加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出用纱布过滤4次过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次加2 mo
39、l/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA注意事项(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利
40、于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。精准命题典例剖析例4(2021南通模拟)对利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验，下列叙述正确的是(B)A用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物B可用木瓜蛋白酶纯化过滤后研磨液中的DNAC由于DNA对高温耐受性较差，故需向DNA滤液中加入冷酒精D将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色解析DNA在浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度最低，因此用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14
41、mol/L时，DNA析出，应该去除滤液；木瓜蛋白酶能分解蛋白质，但不能分解DNA，因此可用木瓜蛋白酶纯化过滤后研磨液中的DNA；由于DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精，因此可向DNA滤液中加入冷酒精以进一步纯化DNA；将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后要经过沸水浴才能呈现蓝色。 对应训练5图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述错误的是(A)A图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同 B图1中完成过滤之后保留滤液C图2中完成过滤之后弃去滤液D在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质解析图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，图2中加
42、入蒸馏水的目的是稀释NaCl溶液，使DNA析出；图1中加入蒸馏水后，DNA存在于滤液中；图2中加入蒸馏水后，NaCl溶液浓度降低，DNA析出，所以弃去滤液；嫩肉粉主要成分是蛋白酶，鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉可将蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，有利于除去蛋白质。6(2019江苏卷，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(A)A用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近BDNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNAD用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热解析哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核，细胞内不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料
43、，A项错误。DNA析出过程中，搅拌要轻柔，以防止DNA断裂，B项正确。DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C项正确。向溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D项正确。课末总结 知识导图思维缕析 学科素养核心释疑1限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。2质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。3基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。4培育转
44、基因动物时，受体细胞必须是受精卵；培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。5目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。6目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。 探究高考明确考向1(2020天津卷，16)型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。据图回答：(1)为使人胰
45、岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是ABCD。A引入短肽编码序列不能含终止子序列B引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列C引入短肽不能改变A链氨基酸序列D引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性(3)在重组表达载体中，Sac和Xba限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成3种DNA片段。(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽重组人胰
46、岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁。(5)用转化的乳酸菌饲喂型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有AB。AB细胞BT细胞C吞噬细胞D浆细胞解析(1)从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。(2)要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码
47、序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。(3)在重组表达载体中，Sac和Xba限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用Sac和Xba限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。(4)乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。(5)人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能
48、识别抗原。2(2020山东卷，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶,_重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基
49、酸序列不发生 (填：发生或不发生)改变，原因是编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经逆转录(或：反转录)过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为品系3，原因是品系3的Wx_mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量
50、最少，糯性最强。解析(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。(2)根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cD
51、NA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。(4)识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。3(2020江苏卷，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR I酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤I用的EcoR I是一种限制性核酸内切(或限制)酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点。(2)步骤用的DNA连接酶催化相邻
52、核苷酸之间的3羟基与5磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 是为了获得DNA单链；TaqDNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤选用的PCR引物必须是(从引物中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物5AACTATGCGCTCATGA35GCAATGCGTAGCCTCT35AGAGGCTACGCATTGC35TCATGAGCGCATAGTT3(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是B。A 5AAC
53、TATGCGAGCCCTT3B 5AATTCCATGCTGAATT3C 5GCAATGCGTTCGGGAA3D 5TTGATACGCCGAGTAC3解析(1)EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3羟基和5磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5端的碱基可以与DNA两条链的3端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延
54、伸方向从53，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为，与右边配对的引物为，故步骤选用的PCR引物应当为。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5端应该是AATTC,3端是GAATT，故选B。4(2020浙江卷，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是(D)A若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定B抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗
55、除草剂基因的转入无关C抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNAD已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置解析若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成
56、，B错误；转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。故选D。5(2019江苏卷，33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：图1(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为平末端。(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段
57、，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为胸腺嘧啶(T)的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在DNA连接酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“”代表生长，“”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是B(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是A类菌落含有P0、C类菌落未转入质粒。菌落类型平板类型ABC无抗生素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示
58、为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。图2解析(1)从图中可以看出，EcoR 酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能
59、在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，若选用另一对甲、乙作引物，会出现目的基因反接扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。6(2018全国卷，38)回答下列问题：(1)博耶(HBoyer)和科恩(SCohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即
60、可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。解析(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质
61、粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。7(2018全国卷，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端，获得了L1
62、GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛
63、的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。解析(1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细
64、胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是核DNA。8(2018江苏， 32)为生产具有特定性能的淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：(1)利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设
65、定，下列选项中的设定与引物有关，的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：5U3图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。(5)获得工程菌表达的淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液50 mmol/LNa2HPO4KH2PO450 mmol/LTrisHCl50 mmol/LGlyNaOHpH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5酶相
66、对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果，初步判断该淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_TrisHCl。解析(1)利用 PCR 技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3端延伸DNA子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的
67、定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，34 kb的延伸时间为34 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上决定一种氨基酸的三个相邻的碱基为一个密码子，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共16种可能性。题干表明控制淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16313种可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。