1、知识系统构建必背要语1.实验室常用巴氏消毒法和使用紫外线或化学药物进行消毒，常用的灭菌方法有火焰灭菌、干热灭菌、间歇灭菌法、蒸汽持续灭菌法和高压蒸汽灭菌法等。2.微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤，划线或涂布最常用的方法是平板划线分离法和涂布分离法。3.平板菌落计数法又称活菌计数法，是微生物数量测定的常用方法。4.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的选择培养基分离该细菌。5.鉴定分解尿素的细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。6.纤维素分解菌能分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和木质素酶等。7.刚果红与纤维素形成红
2、色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。规律方法整合整合一常用的灭菌和消毒方法比较灭菌和消毒种类主要方法应用范围火焰灭菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或三角瓶口等干热灭菌电热鼓风干燥箱160 170 加热12 h玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品巴氏消毒法60 85 下处理1530 min牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体间歇灭菌法100 下蒸煮3060 min连续重复3 d，每天1次含有葡萄糖或氨基酸等不耐高温药品的培养基等蒸汽持续灭菌法100 持续加热3
3、6 h微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备高压蒸汽灭菌法121 维持1530 min培养基及多种器材、物品紫外线消毒30 W紫外灯照射30 min接种室空气化学药物消毒用体积分数为70%75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏儿喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等例1下列有关微生物培养与应用的说法，正确的是()A.天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基B.接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理C.大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段D.分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源答案C解析天然培养基
4、是成分不明确的培养基，并不是不需加工配制的培养基；实验操作者的双手需进行消毒处理；分离分解尿素的细菌时，尿素是唯一氮源但不是唯一的碳源。例2微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，以防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是()煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢接种操作要在酒精灯火焰附近进行家庭制作豆豉时要用高压蒸器灭菌锅灭菌以控制杂菌污染培养基要进行高压蒸汽灭菌加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌A. B.C. D.答案D解析无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可
5、以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中的杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作豆豉时纳豆菌的芽孢对热不敏感，可采用高温控制杂菌污染；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故操作错误。整合二微生物的纯化培养技术1.技术流程2.流程解读(1)无菌技术：主要指消毒和灭菌，实验中对操作者和操作空间进行消毒，对实验用具和培养基进行灭菌。实验过程中严格遵循无菌技术。(2)倒平板：待培养基冷却到50 60 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。(3)平板划线分离法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，培养后获得由单个菌体繁殖形成的菌落，从而实现菌种的纯化
6、培养。(4)涂布分离法：先将菌液进行系列梯度稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落，实现菌种的纯化培养。易错易混(1)自然界中多种微生物混杂在一起，研究菌种时需要将它们分离开来，微生物的纯化培养技术实现了菌种的分离。(2)平板划线分离法操作简单，常用于微生物的分离；涂布分离法操作复杂，稀释度足够高时，培养基上生长的菌落大都是由单个细菌形成的，除用于微生物的分离外，还可进行微生物的计数。例31943年，曾获诺贝尔生理学或医学奖的美国科学家鲁里亚和德尔布吕克设计实验，研究大肠杆菌的抗噬菌体突变是发生在接触噬菌体之前还是之后。请阅读
7、以下资料回答下列问题：培养皿中培养基的基本配方：配方蛋白胨乳糖KH2PO4水琼脂20%伊红水溶液0.325%美蓝水溶液pH含量10 g10 g2 g1 000 mL25 g20 mL20 mL7.27.4(1)在培养基中加噬菌体的作用是_；加伊红与美蓝的目的是_。(2)由于大肠杆菌的同化作用类型是_，因此，在培养基中还加入了一些相应的物质，其中_是大肠杆菌生长的主要碳源，_是氮源。(3)从生态学的角度看，噬菌体与大肠杆菌这两种生物之间的关系是_。(4)该实验有两个假设：假设一：大肠杆菌的抗噬菌体突变发生在大肠杆菌与噬菌体接触之前。假设二：大肠杆菌的抗噬菌体突变发生在大肠杆菌与噬菌体接触之后。你
8、认为图中的实验结果支持上述哪个假设：_，如果另一个假设成立的话，实验结果应该是：_。(5)在这个实验设计中，研究者根据培养皿中菌落数的差异推断，从而证明假设的成立。请你分析出现A4和A5实验结果的原因：_。答案(1)选择具有抗噬菌体突变的大肠杆菌便于识别大肠杆菌菌落(2)异养型乳糖蛋白胨(3)寄生(4)假设一A、B两组所有培养基中菌落数没有显著差异(5)抗噬菌体变异发生的时间A5比A4早，具有抗噬菌体突变的大肠杆菌数较多，培养皿中出现的菌落数就多解析噬菌体与大肠杆菌的关系为寄生，有些大肠杆菌对噬菌体具有抗性，利用加噬菌体的培养基将其筛选出来。伊红美蓝培养基用于特异性鉴别大肠杆菌，其在此培养基上
9、的菌落呈深紫色。大肠杆菌的同化作用类型为异养型，所以培养基中加了乳糖等含碳有机物。由于生物的变异具有不定向性，且通过图示可以看出，将A试管中10 mL菌液先均分到50支试管中再培养24 h以后涂布到50个含噬菌体的平板上，菌落数有了明显差异，说明抗性发生了差异；B试管中10 mL菌液先一起培养24 h后再均分为50份分别涂布，结果各培养基菌落数相当，则说明假设一成立。若假设二成立，则A、B两组所有培养基中菌落数应无显著差异。通过培养基上菌落差异，可以推断出大肠杆菌抗噬菌体变异时间的早晚。A5菌落数为103，A4为7，说明A5变异时间早，经过大量的繁殖，具有抗性的个体远远多于A4。整合三有关分解
10、尿素的细菌和纤维素分解菌的比较1.对比分析尿素分解菌和纤维素分解菌的分离和鉴定项目尿素分解菌的分离纤维素分解菌的分离原理提供有利于目的菌株生长的条件(如营养、温度、pH等)，同时抑制其他微生物的生长，常用选择培养基筛选过程土壤取样样品稀释培养与观察土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布于含刚果红(CR)鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落进一步鉴定鉴定酚红指示剂(变红)刚果红(产生透明圈)培养基选择培养基：固体培养基，尿素为唯一氮源选择培养基：液体，富含纤维素鉴别培养基：固体，加入刚果红2.分解尿素的细菌和纤维素分解菌的分离流程比较分离流程分解尿素的细菌纤维素分解菌土壤取样选择富含有机质
11、的土壤选择富含纤维素的环境选择培养不进行选择培养液体选择培养基，增加纤维素分解菌的浓度梯度稀释梯度稀释到101106倍梯度稀释101105倍涂布平板涂布到选择培养基涂布到鉴别培养基菌种鉴定培养基中加入酚红指示剂培养基中加入刚果红染色剂例4下列关于尿素分解菌和纤维素分解菌的分离的叙述中，错误的是()A.前者需要以尿素为唯一的氮源，后者需要以纤维素为唯一的碳源B.尿素分解菌能产生脲酶，纤维素分解菌能产生纤维素酶C.两个过程中都需要梯度稀释D.刚果红染色法也可以用于鉴定尿素分解菌答案D解析两种细菌的分离都用到选择培养基，分离尿素分解菌的培养基以尿素为唯一氮源，分离纤维素分解菌的培养基以纤维素为唯一碳
12、源，A正确；两种细菌分别产生脲酶和纤维素酶，B正确；由于在样品中细菌的浓度较大，所以都要进行梯度稀释，C正确；刚果红染色法仅能用于纤维素分解菌的鉴定，D错误。热点考题集训1.3个培养皿中分别加入10 mL不同成分的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36小时后，计数菌落数，结果如下表。下列选项不正确的是()培养皿培养基成分菌落数琼脂、葡萄糖35琼脂、葡萄糖、生长因子250琼脂、生长因子0A.该实验采用的是固体平板培养基B.该实验采用涂布分离法接种C.和对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子D.和对照，说明大肠杆菌的生长需要糖类答案C解析培养基中添加了琼脂且能观察到菌落，因此本实验采用的是固
13、体平板培养基，A项正确；对大肠杆菌进行菌落计数用的是涂布分离法，B项正确；和对照，中菌落数比较少，说明生长因子能促进大肠杆菌的生长，C项不正确；和对照，缺少葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能生长，说明大肠杆菌的生长需要糖类，D项正确。2.在微生物的培养中下列说法不正确的是()A.培养基、手、接种针要分别用高压蒸汽、火焰灼烧、酒精进行无菌处理B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，不能以M3作为该样品菌落数估计值C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.纤维素分解菌产生的纤维素酶是一种复合酶，可把纤维素分解成葡萄糖答案A
14、解析培养基、接种针、手要分别用高压蒸汽、火焰灼烧、酒精进行无菌处理、统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以平均值作为该样品菌落数估计值，所以A、B选项符合题意。3.酵母菌培养液常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是()A.碳源供应太充足B.葡萄糖不是酵母菌的原料C.改变了酵母菌培养液的pHD.细胞会发生质壁分离答案D解析当培养基中葡萄糖的浓度升高时，会导致培养液的渗透压升高，从而导致细胞发生质壁分离。4.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素答案D解
15、析能合成脲酶的微生物可以分解尿素，所以氮源为尿素；而这种微生物为异养生物，所以其碳源为含碳有机物葡萄糖。5.淀粉酶可通过微生物发酵生产获得，生产菌株在含有淀粉的固体培养基上可释放淀粉酶分解淀粉，在菌落周围形成透明圈。为了提高酶的产量，研究人员欲利用诱变育种的方法获得能产生较多淀粉酶的菌株。下列实验步骤中不正确的是()A.将生产菌株分为两组，实验组用一定剂量的诱变剂处理，对照组不处理B.制备含水、淀粉、氮源和无机盐等成分的固体培养基，并进行灭菌处理C.把实验组的菌株接种于多个配制好的培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养D.观察两组菌株的菌落周围是否出现透明圈，选出有透明圈的菌株即为所需菌株答
16、案D解析利用诱变育种的方法获得能产生较多淀粉酶的菌株，需要设置对照实验，实验组用诱变剂处理，对照组不处理，从而筛选出淀粉酶产量高的菌株，A项正确；筛选菌株需要将菌种接种到固体培养基上，培养基需在接种前进行灭菌处理，B项正确；为保证实验结果可靠、可信，要进行重复实验，即将菌种接种在多个培养基上，C项正确；产淀粉酶的菌株在菌落周围都形成透明圈，而产量高的菌株形成的透明圈大，因此应选择透明圈大的菌株进行培养。6.利用农作物秸秆等纤维质原料生产的乙醇，经加工可制成燃料乙醇，从而减少了对石油资源的依赖，下图为生产燃料乙醇的简要流程，据图分析错误的一项是 ()A.要得到微生物A，最好选择富含纤维素的土壤采
17、集土样B.图中过程常用的微生物B是酵母菌C.微生物A和微生物B可利用的碳源相同D.可用纤维素酶制剂代替微生物A起作用答案C解析根据图解可知，微生物A的碳源是纤维素，故要想获得微生物A最好选择富含纤维素的土壤采集，A项正确；图中过程表示生产乙醇的过程，常用微生物是酵母菌，B项正确；微生物A所用碳源为纤维素，微生物B所用碳源为纤维素降解物，C项错误；微生物A之所以能利用纤维质原料是因为其含有纤维素酶，故可用纤维素酶制剂代替微生物A起作用，D项正确。7.下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关的叙述中不正确的是()A.实验中所用的培养基均属于选择培养基B.
18、图中、过程实现了对目标微生物的稀释C.统计处培养基中的菌落数并不一定代表接种到上的活菌数D.在处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型答案B解析该实验的目的是从土壤中分离能分解对羟基苯甲酸的微生物，所以使用的培养基为选择培养基，A项正确；图中、过程为选择培养，目的是增大所分离的微生物的浓度，B项错误；处的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是一个或多个活菌繁殖后形成一个菌落，C项正确；所分离的微生物利用现成的有机物生长繁殖，所以该微生物的同化作用类型为异养型，D项正确。8.焦化厂活性污泥中富含难降解的有机物苯甲酰肼，是当前焦化行业环保治理的难题。某同学通过查阅资料发现可通过细菌生物降解方法
19、处理焦化厂污染物。下列有关分析错误的是()A.配制以苯甲酰肼作为唯一碳源的选择培养基进行筛选B.利用平板划线分离法可以对初步筛选出的目的菌进行纯化C.逐步提高培养基中苯甲酰肼的浓度可以得到高效降解污染物的优质菌株D.应该从农田土壤中筛选目的菌答案D9.有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、_、_四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其目的是_。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是_。划线的某个平板培养后，第一划线区
20、域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有_。(3)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是_，该实验设计是否合理？为什么？_。答案(1)氮源无机盐使能利用苯磺隆的微生物正常生长繁殖(2)接种环接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始(3)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质不合理，缺少空白对照解析(1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要从土壤中分离出有降解
21、苯磺隆能力的微生物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。划线的平板培养后，发现第一划线区域的划线上不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，而其他划线上有菌落。造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域第一条线时未从第一区域末端开始。(3)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件相同的空白对照。10.2015年与我国女科学家屠呦呦平分诺贝尔
22、生理学或医学奖的是爱尔兰科学家威廉坎贝尔和日本药物科学博士大村智，他们二人的贡献是发现了一种新的药物，名为阿维菌素，其衍生产品降低了河盲症和淋巴丝虫病的发病率，同时还能有效对抗其他寄生虫病，治疗效果显著。大村智从土壤样品中分离链霉菌的新菌株，在实验室内通过成千上万链霉菌培养物筛选出一些较有发展前途的菌株，这就是阿维菌素的来源。请回答下列问题：(1)制备链霉菌培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是_和灭菌，对培养基进行灭菌的常用方法是_。倒平板时要待平板冷凝后，将平板倒置，其主要原因是_。(2)图的接种方法是将聚集的菌种进行_后，分散到培养基的表面。在培养基上接种时接种环需通过灼烧灭菌，完成图中划线操作，共需要灼烧接种环_次。图表示的是用_法接种培养后得到的结果。(3)在纯化过程中，在固体培养基上划线分离后，经培养，在划线的末端出现_，表明目的菌已分离纯化。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的_的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高_的利用率。答案(1)调节pH高压蒸汽灭菌法防止培养皿盖上的冷凝水珠落入培养基造成污染，并防止培养基水分过快地挥发(2)逐步稀释4涂布分离(3)不连续单个菌落(4)溶解氧营养物质