1、2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体 一、动物细胞融合 1.概念:_个或_个动物细胞结合形成_个细胞的过程,也称_。2.条件:需要用_、_、电激等诱导因素。必备知识自主学习 一 细胞杂交 两 多 聚乙二醇(PEG)灭活的病毒 3.过程(以灭活的病毒诱导融合为例):4.原理:_。5.结果:形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为_。6.意义:突破了_方法的局限,使_成为可能。成为研究细胞遗 传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段,为制造单_ 开辟了新途径。细胞膜的流动性 杂交细胞 有性杂交 远缘杂交 克隆抗体 二、单克隆抗体 1.制备原理:(1)B淋巴细胞特点:一种B淋巴细胞分
2、泌一种特异性抗体。(2)骨髓瘤细胞特点:能在体外无限_。(3)杂交瘤细胞特点:B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞,既能_又能产生大量_。增殖 无限增殖 特定抗体 2.制备过程:3.单克隆抗体的优点:_、_、_。4.单克隆抗体的应用:(1)作为_,具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于_和_。特异性强 灵敏度高 可大量制备 诊断试剂 治疗疾病 运载药物【易错辨析】1.植物原生质体融合与动物细胞融合的基本原理相同。()2.灭活的病毒能促进动物细胞融合,但不能促进植物细胞融合。()3.二倍体动物体细胞融合后的杂交细胞仍是二倍体细胞。()【分析】杂交细胞具有四个染色体组,应该是四倍体细胞
3、。4.单克隆抗体的制备首先要从小鼠体内提取B淋巴细胞。()【分析】制备单克隆抗体首先需将特定抗原注射到小鼠体内,使小鼠体内形 成能够产生特定抗体的B淋巴细胞。5.单克隆抗体制备过程中的两次筛选目的相同。()【分析】两次筛选的目的不同。第一次是从融合细胞里筛选出杂交瘤细胞,第二次是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。6.体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体。()【分析】体细胞杂交技术可用于制备单克隆抗体,而克隆动物是通过细胞核 移植产生的。关键能力合作学习 一、动物细胞融合 1.过程解读:(1)融合过程:细胞膜融合细胞质融合细胞核融合。(2)细胞融合的实质及结束的标志:细胞核融合。(3)细
4、胞膜融合的过程体现出细胞膜具有一定的流动性。(4)重组细胞的特点:融合形成的杂种细胞具有两种细胞的遗传信息,其染色体数目、基因组成、染色体组都是两个细胞之和,通过动物细胞培养,杂种细胞可表现出两个亲本细胞的特点。2.植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较:比较 项目 植物体细胞杂交(番茄-马铃薯植株)动物细胞融合(单克隆抗体制备)过 程 第1步 原生质体的制备(酶解法)正常小鼠的处理(注射灭活抗原)第2步 原生质体的融合(物化法)动物细胞融合(物化生法)第3步 杂种细胞的筛选和培养 杂交瘤细胞的筛选和培养 第4步 杂种植株鉴定 提纯单克隆抗体(特异性强、灵敏度高)原理 细胞膜的流动性、植物细胞的全
5、能性 细胞膜的流动性、细胞增殖 融合前 处理 酶解法除去细胞壁:纤维素酶、果胶酶 注射特定抗原,免疫处理正常小鼠 诱导 方法 物理法:电激、离心、振动等 化学法:聚乙二醇等 物化法:与植物的相同 生物法:灭活的病毒 意义和 用途 克服不同物种间远缘杂交不亲和的障碍 培育作物新品种 制备单克隆抗体 有助于疾病的诊断、治疗、预防 易错提醒:病毒在生物技术中的应用(1)灭活的病毒能作为诱导剂,不灭活的病毒不能作为诱导剂。(2)病毒在不同过程或操作中的“身份不同”。在免疫调节中病毒属于抗原,在基因工程中可作为载体,在细胞工程中可作为诱导剂。【选修对接必修】对接必修1:细胞结构 细胞融合的基本原理:细胞
6、膜具有一定的流动性,可以通过离心、振荡、电激、聚乙二醇、_诱导细胞融合。对接必修2:染色体变异 杂交细胞中的染色体组数目_融合细胞染色体组数目之和。灭活的病毒 等于【典题通关】如图表示细胞工程的流程图(a、b表示过程),请据图回答下列问题:(1)若图示为动物细胞融合的过程,则a特有的诱导剂是_。以动物细胞融合为基础发展起来的杂交瘤技术为制造单克隆抗体开辟了新途径,通过把能产生抗体的_细胞与能在体外大量增殖的_细胞进行融合,得到既能迅速大量繁殖,又能产生专一抗体的杂交瘤细胞。(2)若图示为植物体细胞杂交过程,则在甲、乙融合之前,需要用_(填酶)制备_。这项工程的意义是_。(3)由甲、乙融合得到丙
7、细胞的基本原理是_。【解题关键】(1)信息获取:本题结合细胞工程的流程图考查从题干及题图中获取信息的能力。(2)对比答题:结合动物细胞融合和植物体细胞杂交的异同进行分析解答。【解析】(1)若a诱导动物细胞融合,则特有的诱导剂是灭活的病毒。在单克隆抗体的制备过程中,利用已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞,该细胞既可以迅速大量增殖,又可以产生专一的抗体。(2)在植物体细胞杂交过程中,需要对甲、乙细胞先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁得到原生质体,然后再诱导甲、乙的原生质体融合。该技术可以克服远缘杂交不亲和的障碍,扩大亲本组合的范围。(3)甲、乙细胞融合形成丙细胞,利用了细胞膜的流动性。
8、答案:(1)灭活的病毒 B淋巴 骨髓瘤(2)纤维素酶和果胶酶 原生质体 克服远缘杂交不亲和的障碍,扩大亲本组合的范围(3)细胞膜的流动性【误区警示】(1)该细胞工程的流程图既可以表示动物细胞融合又可以表示植物体细胞杂交。(2)明确动物细胞融合、植物体细胞杂交的原理、过程、结果、意义的异同点,掌握灭活病毒是动物细胞融合特有的诱导剂,明确动物细胞融合、植物原生质体融合的原理都是细胞膜的流动性。【跟踪小练】1.(2018江苏高考改编)如图为细胞融合的示意图,下列叙述正确的是()A.若a细胞和b细胞是植物细胞,需先去分化再诱导融合 B.a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现 C.c细胞的形成与
9、a、b细胞膜的流动性无关 D.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因【解析】选B。本题考查细胞工程相关知识。a、b如果为植物细胞,则需要去细胞壁,但不需要去分化,A项错误;两细胞融合需要用物理或化学等方法使其融合,其融合过程体现了细胞膜具有一定的流动性,B项正确,C项错误;融合后的杂种细胞中的基因仍是选择性表达,不会表达全部的基因,D项错误。2.Hela细胞系是人工培养、具有无限增殖能力的永生癌细胞系,在世界各地的相关实验室中为研究者提供了相同的研究对象。回答下列问题:(1)Hela细胞源自一位美国妇女的宫颈癌细胞,目前实验室中为了进一步研究Hela细胞,需进行_(填“原代”或“传代”)培
10、养,细胞体外培养所需营养物质有糖、氨基酸、无机盐等,通常还需要加入_等天然成分。在动物细胞培养过程中,需要用胰蛋白酶,而不用胃蛋白酶的原因是 _ _。(2)某小组为研究葡萄糖饥饿对Hela细胞生长的抑制情况,其他营养条件适宜,用不同葡萄糖浓度的培养基培养Hela细胞24 h,实验结果如表所示:葡萄糖浓度/(mmolL-1)Hela细胞生长抑制率/%056.161.036.301.525.002.016.44该实验_(填“需要”或“不需要”)另设对照组。实验结果表明:葡萄糖浓度与Hela细胞生长抑制率的关系是_。体内低浓度葡萄糖可_癌细胞的增殖,为肿瘤的限食疗法提供理论依据。(3)Hela细胞在
11、生物医学领域应用广泛,例如它帮助科学家首次实现了人源细胞与小鼠细胞融合。两个或多个细胞融合形成的单核细胞叫做_,细胞融合技术的意义是_。【解析】(1)目前实验室中为了进一步研究Hela细胞,需进行传代培养,细胞体外培养所需营养物质有糖、氨基酸、无机盐等,通常还需要加入血清、血浆等天然成分。在动物细胞培养过程中,需要用胰蛋白酶,而不用胃蛋白酶的原因是在多数动物细胞培养液适宜的pH范围内,胃蛋白酶已失去活性。(2)分析表格数据,该实验需要另设对照组,观察在正常条件下细胞生长情况。实验结果表明:葡萄糖浓度与Hela细胞生长抑制率的关系是葡萄糖浓度越低,Hela细胞生长抑制率越高。体内低浓度葡萄糖可抑
12、制癌细胞的增殖,为肿瘤的限食疗法提供理论依据。(3)两个或多个细胞融合形成的单核细胞叫做杂交细胞,细胞融合技术的意义是突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。答案:(1)传代 血清、血浆 在多数动物细胞培养液适宜的pH范围内,胃蛋白酶已失去活性(2)需要 葡萄糖浓度越低,Hela细胞生长抑制率越高 抑制 (3)杂交细胞 突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能 二、单克隆抗体 1.技术手段:人工免疫、动物细胞培养、动物细胞融合,其中基础技术是动物细胞培养。2.制备流程:(1)关键的操作:对小鼠注射特定的抗原;细胞融合;两次筛选;培养杂交瘤细胞,制备单克隆抗体。(2)对动物进行免疫的原
13、因:B淋巴细胞要经过免疫过程,即接触抗原,增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞,才能产生相应的抗体,所以与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是效应B细胞(浆细胞)。(3)两次筛选:项目第一次筛选第二次筛选筛选 原因诱导融合后得到多种杂交细胞,另外还有未融合的细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激,所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 筛选 方法用特定的选择培养基筛选;未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(B-B杂交细胞、瘤-瘤杂交细胞)都会死亡,只有杂交瘤细胞(瘤-B杂交细胞)才能生长 用多孔培养皿培养,在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测,经多
14、次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞 筛选 目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗 体的杂交瘤细胞(4)杂交瘤细胞的特点:具备两个亲本细胞的遗传物质,不仅具有已免疫的B淋巴细胞产生特异性抗体的能力,还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力,从而可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点,而大量生产单克隆抗体。(5)提取场所。体外培养培养液中提取,该方法培养容易,分离、提纯抗体困难。体内小鼠腹腔中培养小鼠腹水中提取,该方法分离、提纯抗体容易,但培养困难。3.两种抗体的比较:名 称产 生特 点血清抗体由浆细胞分泌一般从血清中分离,产量低、纯度低、特异性差单克隆 抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强,灵敏
15、度高,能大量制备4.三种细胞的比较:细胞类型来 源特 点已免疫的 B淋巴细胞由B淋巴细胞或记忆细胞受抗原刺激后增殖分化而来能产生单一抗体,但不能无限增殖骨髓瘤细胞从骨髓肿瘤中提取能无限增殖,但不能产生抗体杂交瘤细胞浆细胞与骨髓瘤细胞融合而成既能产生抗体,又能无限增殖【典题通关】(2020全国卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_。（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_ _。（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基
16、属于_，使用该培养基进行细胞培养的结果是_。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_。（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有_（答出2点即可）。【解题关键】解题时注意两个关键点：（1）与骨髓瘤细胞进行融合的是已经进行免疫的B淋巴细胞。（2）两次筛选的目的不同。第一次筛选是指用选择培养基筛选出杂交瘤细胞。第二次筛选是指进行克隆化培养和专一抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。【解析】本题主要考查动物细胞培养、动物细胞融合与单克隆抗体的制备。（1）实验前给小鼠甲注射病毒A，是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。（2）制备单细胞悬液时可
17、以取小鼠的脾脏，剪碎组织，用胰蛋白酶处理获得单个细胞，加入培养液即可。（3）图中筛选1需要用到选择培养基，只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，该过程要用到抗原抗体杂交，故筛选所依据的原理是抗原与抗体反应具有特异性。（4）获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，生产单克隆抗体的过程有体外培养和体内培养两条途径。体外培养是指在体外培养液中进行培养，从培养液中提取单克隆抗体；体内培养是指将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖，从小鼠腹水中提取单克隆抗体。答案：（1）诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞（2）取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，
18、加入培养液制成单细胞悬液（3）选择培养基只有杂交瘤细胞能够生存抗原与抗体的反应具有特异性（4）将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养【跟踪小练】1.(2020扬州高二检测)如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述,正确的是()A.是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T细胞 B.中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成 C.同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性 D.是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群【解题关键】解答本题首先要弄明白图中各序号的含义:是效应B细胞(浆细胞),过程是动物细胞融合,是杂交细胞,过程是筛选杂交瘤细胞。【解析】选D。本题考查动物细胞工程中的制备单
19、克隆抗体。是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应B细胞(浆细胞),A项错误;胰蛋白酶可使组织分散为单个细胞,B项错误;为杂交细胞,若是浆细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交细胞,才同时具有(效应)B淋巴细胞(可产生抗体)和骨髓瘤细胞(可无限增殖)的特性,C项错误;是经筛选后获得的能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,D项正确。2.美国科学家弗朗西丝阿诺德、乔治史密斯和英国科学家格雷戈里温特因为“肽和抗体的噬菌体展示”方面做出的贡献,获得了2018年诺贝尔化学奖。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随噬菌体外壳蛋白的表达而表达。同时,外源蛋白或多肽随噬菌体的
20、重新组装而展示到噬菌体表面。利用该技术可以获得单克隆抗体。请回答下列问题:(1)传统单克隆抗体的获得需先对小鼠进行_处理,整个过程中涉及的动物细胞工程技术有_。(2)外源DNA片段含_个游离的磷酸。为了得到大量的外源DNA,可使用PCR技术进行体外扩增。合成引物_(填“需要”或“不需要)知道整个外源DNA序列,合成的引物间不能进行碱基互补配对的原因是_。(3)噬菌体展示技术获得的抗体还可用于定量检测抗原,如双抗体夹心法(如图):分析图示可知,固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合,这是由于不同抗体可与同一抗原表面的_结合。该检测方法中,可通过测定产物量来推测_。【解析】(1)传统单克隆抗体的获得需要
21、先对小鼠注射特定抗原蛋白,从而获得经过免疫的淋巴细胞。然后再与骨髓瘤细胞进行动物细胞融合。整个过程中涉及的动物细胞工程技术有动物细胞培养、动物细胞融合。(2)每个DNA分子的每条单链上各有一个游离的磷酸基团,因此外源DNA片段含2个游离的磷酸。一般情况下,在需要大量的某一基因的片段时,在基因的两端分别设计引物(一端一条),然后在体外采用PCR的方法,用引物进行体外DNA复制,从而大量合成引物之间的基因。因此不需要知道整个外源DNA序列,只需要设计好引物,其余部分可通过碱基互补配对原则自动完成。由于引物的模板分别位于外源DNA的两端,而两端的模板序列并不能进行碱基互补配对,因此合成的引物间不能进
22、行碱基互补配对。(3)抗体与抗原的结合具有特异性,因此不同抗体可与同一抗原表面的不同部位结合。可通过测定产物量来推测抗原量。答案:(1)注射特定的抗原蛋白(免疫)动物细胞培养、动物细胞融合 (2)2 不需要 两种引物的模板分别位于外源DNA的两端,而两端的模板序列并不能进行碱基互补配对(3)不同部位 抗原量【补偿训练】(2020石家庄高二检测)经过世界各国科学家的漫长探索,植物细胞工程技术已进入高速发展阶段,动物细胞工程技术已成为生物科学领域一颗十分耀眼的明珠。请回答下列相关问题:(1)植物组织培养过程中,由于培养细胞处于_状态,因此容易受到培养条件和外界影响而发生突变。若对愈伤组织进行物理或
23、化学诱变处理,促使其发生突变,再通过_形成植株,从中筛选出抗病、高产优质的突变体,就可以培育成新品种。(2)用植物体细胞杂交技术培育番茄马铃薯,就是将这两种植物体细胞,在一定条件下_ _。这项研究虽然没有地上长番茄,地下结马铃薯,但是在 _ _ 上取得了重大突破。(3)一种由正常体细胞经人工逆转后形成的多能干细胞iPSC经基因修饰后分化成特定的T淋巴细胞。体外培养iPSC过程中,通常需要在培养基中添加_等天然成分。(4)制备抗人绒毛膜促性腺激素的单克隆抗体过程中,需要用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,该细胞的特点是 _,对杂交瘤细胞还需进行_培养,并用_对其进行专一抗体检测,经多次筛选获得足
24、够数量的所需细胞进行体内或体外培养。【解析】(1)植物组织培养过程中,由于培养细胞处于分生状态,因此容易受到培养条件和外界影响而发生突变。若对愈伤组织进行物理或化学诱变处理,促使其发生突变,再通过诱导分化形成植株,从中筛选出抗病、高产优质的突变体,就可以培育成新品种。(2)植物体细胞杂交技术能在一定条件下将两种植物细胞融合形成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新的植物体。在克服不同生物远缘杂交的障碍上取得了重大突破。(3)动物细胞培养过程中,通常需要在培养基中添加血清、血浆等天然成分。(4)杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量繁殖,又能产生专一(特异性)抗体,对杂交瘤细胞还需进行克隆培养,并用人绒毛膜促性腺激素对其进行专一抗体检测,经多次筛选获得足够数量的所需细胞进行体内或体外培养。答案:(1)分生(或不断分裂或脱分化)诱导分化(或再分化)(2)融合形成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新的植物体 克服不同生物远缘杂交的障碍(或克服生殖隔离)(3)血清、血浆(4)既能迅速大量繁殖,又能产生专一(特异性)抗体 克隆 人绒毛膜促性腺激素