1、专题1 基 因 工 程 1.1 DNA重组技术的基本工具 一、基因工程的概念、优点和理论基础 1.基因工程的概念:(1)操作环境:生物体外。(2)操作水平:_水平。(3)主要技术:_和_等技术。(4)供体:提供_。(5)受体:_目的基因的细胞。(6)操作目的:赋予生物新的_,创造出更符合人们需要的新的_ 和生物产品。(7)转基因生物发生的变异类型:_。必备知识自主学习 DNA分子 体外DNA重组 转基因 目的基因的细胞 接受并表达 遗传特性 生物类型 基因重组 2.基因工程的优点:(1)与杂交育种相比:克服了_的障碍。(2)与诱变育种相比:_改造生物的遗传性状。3.基因工程实现的理论基础:(1
2、)不同生物的DNA实现成功拼接的原因。化学成分相同:所有生物的DNA都以4种_为基本单位。空间结构相同:一般情况下,DNA分子具有独特的_结构。远缘杂交不亲和 定向 脱氧核苷酸 双螺旋(2)某种生物的基因能在另一种生物细胞内表达的原因:_ _。(3)基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能的基本单位,具有一定的 _,这为目的基因在受体细胞中的表达提供了前提条件。所有生物共用一套遗 传密码 独立性 二、基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶(简称限制酶)“分子手术刀”:(1)来源:主要是从_生物中分离纯化出来的。(2)作用:识别双链DNA分子的某种特定_,并使每一条链中特定部位 的两个核苷酸之
3、间的_断开。(3)结果:产生_或平末端。2.DNA连接酶“分子缝合针”:(1)DNA连接酶的作用:将_“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个 核苷酸之间的_。原核 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 双链DNA片段 磷酸二酯键(2)DNA连接酶的种类、来源和特点:种 类 来 源 特 点 _ DNA连接酶 _ 只能“缝合”具有_的双链DNA片段 T4DNA 连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的_,又可 以“缝合”双链DNA片段的_ Ecoli 大肠杆菌 互补黏性末端 黏性末端 平末端 3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”:(1)种类:通常用_作为载体,另外还有 噬菌体的衍生物和
4、_等。(2)载体的作用。将目的基因_到受体细胞中去。在受体细胞内对目的基因进行大量_。(3)作为载体必须具备的条件。在宿主细胞中能保存下来并大量_。有一个至多个_。有特殊的_,便于筛选。对_无害。质粒 动植物病毒 转运 复制 复制 限制酶切割位点 标记基因 受体细胞 三、重组DNA分子的模拟操作 1.材料用具:剪刀代表_,透明胶条代表_。2.切割位点:(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出GAATTC序列,并选 G-A之间作切口进行“切割”。(2)再从另一条链上_之间寻找EcoR相应的切口剪开。(3)目的基因两侧都有“切割”位点,载体上至少有一处“切割”位点。3.操作结果:若操作正确,不
5、同颜色的黏性末端应能_;否则,说明操作 有误。EcoR DNA连接酶 互补的碱基 互补配对【易错辨析】1.基因工程的原理是基因重组。()2.DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。()【分析】注意是“工具酶”,载体不是酶。3.DNA聚合酶可以将目的基因和载体连接在一起。()【分析】DNA聚合酶的作用是将单个的脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上,即一 个一个地往上“聚”,而目的基因和载体都是DNA片段。4.限制酶只能用于切割目的基因()【分析】限制酶既能用于切割目的基因,也能用于切割载体。5.不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。()6.载体质粒通常采用抗生素合成基因
6、作为筛选标记基因。()【分析】载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。7.载体的种类有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等,其中动植物病毒必 须是DNA病毒。()8.DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端,故该酶没有专一性。()【分析】任何酶都具有专一性。酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类化 学反应,黏性末端相连接属于一类合成反应。关键能力合作学习 一、基因工程的工具酶 1.限制酶:(1)限制酶的作用。限制酶具有特殊的识别和切割功能,在基因工程中,一方面被用于切割含目的基因的DNA分子,以获取目的基因;另一方面用于切割载体。(2)限制酶切割产物类型。EcoR限制酶识别的碱基序列是
7、GAATTC,切割位点在G和A之间,产生黏性末端,如图1。Sma限制酶识别的碱基序列是CCCGGG,切割位点在C和G之间,产生平末端,如图2。(3)限制酶的特性:限制酶具有专一性。2.DNA连接酶:(1)作用。将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。(2)连接方式。DNA连接酶可把黏性末端或平末端之间的缝隙“缝合”起来,相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来,形成两个磷酸二酯键,而与碱基之间的氢键形成无关。如图:3.限制酶的选择依据:(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst。不能选择切割
8、位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不是一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。易错提醒:与DNA有关的酶的作用不同(
9、1)限制酶作用于DNA,使特定部位的磷酸二酯键断开。(2)DNA连接酶作用于DNA片段,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,将两个DNA片段连接为一个DNA分子。(3)DNA聚合酶作用于脱氧核苷酸,将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端。(4)DNA水解酶作用于DNA,将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸。(5)解旋酶作用于DNA,将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链。(6)RNA聚合酶识别DNA上的特定碱基序列,启动转录过程,使单个核糖核苷酸依次连接到单链末端。【选修对接必修】对接必修1 酶的特性(1)酶具有哪些特性?提示:专一性、高效性、作用条件较温和。(2)限制酶具有专一性吗?提示:具有专一性
10、,限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。对接必修2 DNA复制与PCR(1)DNA分子复制时在_的作用下,利用细胞中游离的4种脱氧核糖核苷 酸为原料,按照_原则,各自合成与母链互补的一段子链。(2)PCR是生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,需要热稳定_ _参与。DNA聚合酶 碱基互补配对 DNA聚合酶(Taq酶)【典题通关】(2016全国卷节选)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点,图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯
11、一的)。根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。(2)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有 和 ,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 。【解题关键】解答本题关键有两点:(1)理解目的基因与质粒拼接的条件:两者有相同的黏性末端。(2)知道抗生素抗性基因的作用:筛选具有抗药性的细菌。【解析】本题主要考查限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用及基因表达载体的构建。(1)BamH和Sau3A的共同识别序列是GATC,二者切割形成的黏性末端相同,可以被DNA连接酶连接。(2)常见的DNA连接酶有T4 D
12、NA连接酶和Ecoli DNA连接酶,T4 DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端。答案:(1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 【误区警示】(1)易忽略图中关键信息,对图示中三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点认识不明。(2)混淆对Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的作用特点。【跟踪小练】1.下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是()A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列 B.限制性核酸内切酶的活性受温度、pH的影响,总有一个最合适的条件 C.限制性核酸
13、内切酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键 D.限制性核酸内切酶不只存在于原核生物中,其合成场所是核糖体【解析】选A。本题考查基因工程的“分子手术刀”限制酶的作用、特点和来源。限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列,不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列,A项错误;同其他的酶一样,限制酶同样受温度和pH的影响,而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH,B项正确;限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂,属于水解反应,C项正确;限制酶主要从原核生物中分离纯化,也有来自真核细胞的,其本质是蛋白质,在核糖体上合成,D项正确。2.(2018北京高考)用Xho 和Sal 两种限制性核酸内切酶
14、分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA C.泳道中是用Sal 处理得到的酶切产物 D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA【解题关键】(1)题眼:限制性核酸内切酶。(2)解题关键:限制性核酸内切酶识别的是双链DNA的特定的核苷酸序列。(3)解题思路:酶的特异性;根据不同的酶有几个酶切位点可以判断最终有几个DNA片段。【解析】选D。因为酶具有特异性,所以两种酶识别的核苷酸序列不同,A项正确;酶切产物可以用于构建重组DNA,B项正确;泳道中有3条较短的片段和1条较长的片段,共4个片段,
15、符合Sal 处理得到的酶切产物,C项正确;图中被酶切的DNA片段是双链DNA,D项错误。【补偿训练】1.一环状DNA分子,设其长度为1,限制酶A在其上的切点位于0.0处;限制酶B在其上的切点位于0.3 处;限制酶C的切点未知,但C单独切或与A或与B同时切的结果如表,请确定C在该环状DNA分子上的切点应位于图中的哪处()C单独切长度为0.8和0.2的两个片段C与A同时切长度为2个0.2和1个0.6的片段C与B同时切长度为2个0.1和1个0.8的片段A.0.2和0.4处 B.0.4和0.6处 C.0.5和0.7处 D.0.6和0.9处【解题关键】(1)图示信息:明确限制酶A、B的切点位置分别是0.
16、0处和0.3处。(2)关键信息:限制酶C与限制酶A或限制酶B同时切时,可先考虑限制酶A或限制酶B先把环状DNA切开成为线状DNA分子,然后再被限制酶C切割。【解析】选A。据图表信息可知:限制酶C单独切割环状DNA分子,获得长度为0.8和0.2的两个片段,可推知限制酶C有2个切割位点,而限制酶A 只有1个切割位点,且位于0.0处。又知限制酶C与限制酶A同时切割时,获得2个0.2和1个0.6的片段,因此以限制酶A切割点向左或向右推测,可得知限制酶C的切割位点可能为0.2、0.4或0.6、0.8处。再根据限制酶C与限制酶B同时切割时,获得2个0.1和1个0.8的片段,可推知限制酶C的切割位点可能为0
17、.1、0.2或0.4、0.5处。综上分析,只有0.2和0.4两处与之前推测相吻合,选项A正确。2.如图所示的酶M和酶N是两种限制酶,图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类,其他碱基的种类未注明。(1)酶M特异性切割的DNA片段是 ,则酶N特异性切割的DNA片段是 。(2)多个片段乙和多个片段丁混合在一起,用DNA连接酶拼接得到环状DNA,其中 只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有 种。【解题关键】(1)运用逆向思维,将切口“缝合”,寻找特定序列。(2)既要找出相同或互补的黏性末端,又要注意题干里的条件“多个”。【解析】本题考查限制酶的切割特点。限制酶识别的一般是DNA上特定的回文序列
18、,切割的是特定部位的磷酸二酯键。既然酶M识别的是片段乙和丙相接后的特定序列,那么酶N识别的就一定是片段甲和乙相接后的特定序列,这两个序列都具有回文的特点。片段乙和片段丁是同种限制酶切割后形成的,二者存在互补的黏性末端,完全可以首尾相接,形成环状的DNA分子(乙-丁);又由于是多个片段混合在一起,乙和丁本身也会分别发生“两两”连接,形成乙-乙和丁-丁两种环状的DNA分子。答案:(1)(2)3【误区警示】(1)限制酶识别的序列一般是特定的回文核苷酸序列;DNA连接酶连接的是相同或互补的黏性末端,而有的DNA连接酶连接平末端后也会形成特定的回文序列。(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端,相同的
19、黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割,但同样能相互连接。二、基因工程中常用的载体质粒 1.特点:质粒是一种裸露的、小型、双链、环状DNA分子。2.本质:质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型DNA分子,不是细胞器。3.质粒作为载体必须具备的条件:条 件意义稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个 限制酶切割位点可携带多个 或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择无毒害作用避免受体细胞受到损伤4.作用:(1)作为运输工具,将目的基因导入受体细胞。(2)质粒携带目的基因在受体细胞内大量复制。易错提醒:基因工程中载体的三点提醒(1)细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别。
20、化学本质不同:细胞膜上的载体化学成分是蛋白质;基因工程中的载体可能是物质,如质粒(DNA)、噬菌体的衍生物,也可能是生物,如动植物病毒等。功能不同:细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把目的基因导入受体细胞。(2)载体需要加工:一般来说,天然载体不能同时满足所有条件,要对其进行人工改造才可以使用。(3)标记基因的筛选原理。前提:载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。过程:含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性,然后在培养基中加入该抗生素
21、。结果:在培养基上,被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞,没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。【典题通关】(2016全国卷)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后,与用BamH酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件
22、有 (答出两点即可)。而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是 ;并且 和 的细胞也是不能区分的,其原因是 。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有 的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自 。【解题关键】(1)掌握基因工程中载体应具备的基本条件。(2)明确抗性基因的作用,能够依据题干信息灵活利用。熟练掌握病毒增殖的相关知识。【解析】本题考查基因工
23、程的相关知识。(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为:具有一个至多个限制酶切点;具有自我复制能力;带有标记基因;对受体细胞无害。(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长,这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上,四环素抗性基因被破坏,在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上,不能生长的为要筛选的菌落,即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体营寄生生活,能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。
24、答案:(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长 四环素(3)受体细胞【误区警示】用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选时,只要氨苄青霉素抗性基因结构完整,又成功地导入受体细胞并成功表达的细胞都能生长,反之则不能生长。【跟踪小练】1.(2020辽宁联考)质粒是细菌中的有机分子,下列对其描述,正确的是()A.质粒完全水解后最多可产生4种化合物 B.质粒能够自我复制 C.质粒中含有两个游离的磷酸基团 D.质粒是基因工程的工具酶【解题关键】明确质粒的
25、本质:独立于细菌拟核DNA之外,具有自我复制能力的小型双链环状DNA分子。【解析】选B。质粒是一种具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子,不含游离的磷酸基团,完全水解后最多可产生6种化合物:脱氧核糖、磷酸、4种含氮碱基,A、C错误,B正确;质粒是基因工程的载体,不是工具酶,D错误。2.某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性核酸内切酶位点如图所示,最好选用下列哪种质粒作为载体()【解题关键】分析目的基因两侧限制酶切割位点的分布情况,并能据此选出最合适的载体。【解析】选D。目的基因只有一侧含有限制酶Nhe的识别序列,只用此酶不能获取目的基因,A不符合题意;目的基因两侧均含有限制酶Alu的识别序
26、列,但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒反向连接或自身环化,B不符合题意;目的基因两侧分别含有限制酶Nhe和Alu的识别序列,但用这两种酶切割可能会获得不含目的基因的片段,C不符合题意;目的基因两侧分别含有限制酶Nhe和Sma的识别序列,用这两种酶切割可获取目的基因,而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接,D符合题意。【补偿训练】限制酶Mun和限制酶EcoR 的识别序列及切割位点分别是 和 。如图表示四种质粒和目的基因,其中,质粒上箭头所指部位为酶 的识别位点,阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是()【解题关键】作为载体的质粒必须与目的基因具有相同的限制酶切点,并且该切点不能破坏质粒的标记基因。【解析】选A。用限制酶Mun切割A质粒后,不会破坏标记基因,而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端,适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因,不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因,但用限制酶切割后会被破坏,因此不适于作为目的基因的载体。